核酸分析仪校准规范

JJF1817—20201核酸分析仪校准规范1范围本规范适用于基于凝胶电泳原理对核酸片段的长度和浓度进行分析的核酸分析仪的校准,适用的核酸片段的长度范围为(100~1000)bp,对于超出此片段长度范围的核校准。2引用文件本规范引用了下列文件:JJF1265—2010生物计量术语及定义凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本规范;凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本规范。3术语和计量单位3.1片段长度fragmentlength表示核酸片段的大小,以核苷酸数目(nt)或碱基对数目(bp)为单位。3.2碱基对(bp)basepair核酸中两条链间的配对碱基。如腺嘌呤-胸腺嘧啶(A-T)对、腺嘌呤-尿嘧啶(A-U)、鸟嘌呤-胞嘧啶(G-C)对、鸟嘌呤-尿嘧啶(G-U)对等。碱基对数目是表征DNA或双链RNA的长度。[JJF1265—2010,4.41]4概述核酸分析仪(以下简称分析仪)是基于凝胶电泳技术原理,将不同大小的双链核酸片段进行分离,在荧光染料存在的条件下,荧光染料嵌入双链核酸中发出荧光,对荧光信号进行检测分析的仪器,可根据各核酸片段的电泳时间和荧光信号值进行定性、定量分析。分析仪通常由进样器、毛细管/微芯片、荧光检测光学部件、微电路控制部件、计算机及应用软件组成,可用于单个和多重PCR片段、限制性内切酶消化的DNA等片段长度和浓度的分析。5计量特性5.1示值误差片段长度示值误差和片段浓度示值误差。5.2重复性JJF1817—20202片段长度重复性和片段浓度重复性。5.3片段浓度线性6校准条件6.1环境条件实验室环境应当满足分析仪安装的要求,不得存在强烈的机械振动和电磁干扰,校准时实验室温度应当控制在(15~30)℃,相对湿度不大于80%,并确保校准过程中环境温度变化小于3℃。6.2校准用标准物质和校准设备6.2.1标准物质应采用国内外有证标准物质,如DNA片段标准物质,片段浓度≥40ng/μL,相对扩展不确定度≤5%(k=2),片段长度范围(100~1000)bp。6.2.2校准用试剂和溶液按照附录A配制校准用试剂和标准溶液。根据被校准仪器型号选择配套的试剂盒。校准用标准物质保存在-20℃,配套试剂盒保存在4℃。6.2.3移液器量程范围(1~10)μL、(10~100)μL,经检定合格。7校准项目和校准方法校准前将低温保存的标准物质及配套试剂提前拿出冰箱,平衡30min后按照附录A配制及使用标准溶液。打开仪器,预热10min。7.1示值误差7.1.1校准板的准备参照试剂盒说明书,用移液器将示值误差校准用标准溶液加入到校准板中。若校准板为3×4孔的芯片模式,按照表1所示准备校准板;若校准板为12联排管模式,按照表2所示准备校准板;其他模式的校准板可参照表1和表2准备,空白用一级水代替标准溶液。表1校准板为3×4孔的芯片模式时的加样排布孔号样品1~3标准溶液标准溶液标准溶液4~6标准溶液标准溶液标准溶液7~9标准溶液标准溶液标准溶液10~12标准溶液空白空白JJF1817—20203表2校准板为12联排管模式时的加样排布孔号123456789101112样品标准溶液标准溶液标准溶液标准溶液标准溶液标准溶液标准溶液标准溶液标准溶液标准溶液空白片段长度标准品注:片断长度标准品为配套试剂盒内的长度标准品。7.1.2片段长度示值误差参照仪器说明书,将准备好的校准板置于分析仪内进行测量。记录10次片段长度测定值,按式(1)计算片段长度示值误差。ΔCbp=Cbp-Cbps(1)式中:ΔCbp—片段长度示值误差,bp;Cbp—片段长度测量的算术平均值(保留整数),bp;Cbps—片段长度标准值,bp。7.1.3片段浓度示值误差参照仪器说明书,将准备好的校准板置于分析仪内进行测量。记录10次片段浓度测定值,按式(2)计算片段浓度示值误差。ΔCcon=Ccon-Ccons(2)式中:ΔCcon—片段浓度示值误差,ng/μL;Ccon—片段浓度测量的算术平均值,ng/μL;Ccons—片段浓度标准值,ng/μL。7.2重复性参照7.1.1的加样方式,重复测量10次标准溶液的片段长度和片段浓度,按式(3)分别计算相对实验标准偏差,作为片段长度重复性和片段浓度重复性。RSD=(nX-iX)2××100%(3)式中:RSD—相对实验标准偏差,%;Xi—第i次DNA标准物质的片段浓度或片段长度测得值,ng/μL或bp;X—n次片段浓度或片段长度测得值的算术平均值,ng/μL或bp;n—测量次数。7.3浓度线性7.3.1校准板的准备参照试剂盒说明书,用移液器将配制好的0.1ng/μL、1ng/μL、4ng/μL、10ng/μL、40ng/μL的DNA片段浓度线性标准溶液加入到校准板中,每个浓度加样2次,按表1或表JJF1817—202042所示排布准备校准板,其他模式的校准板可参照表1和表2准备,空白用一级水代替标准溶液。7.3.2片段浓度线性参照仪器说明书,将准备好的校准板置于分析仪内进行测量。每个浓度的线性标准溶液进行2次重复测量,取其浓度的算术平均值,根据标准溶液的浓度标准值为横坐标和测得的浓度平均值为纵坐标进行线性回归,按式(4)计算线性相关系数γ。(Ci-C)(Csi-Cs)γ(4)(Ci-C)2·(Csi-Cs)2式中:γ—线性相关系数;Ci—第i种线性标准溶液的浓度测量值,ng/mL;C—线性标准溶液的浓度测量值的算术平均值,ng/mL;Csi—第i种线性标准溶液的浓度标准值,ng/mL; Cs—线性标准溶液的浓度标准值的算术平均值,ng/mL;n—线性标准溶液的浓度个数。8校准结果表达按本规范进行校准,原始记录格式参考附录B,不确定度评定参照附录D,校准结果在校准证书上反映,校准证书应符合JJF1071—2010中5.12的要求,参照附录C给出校准项目名称、测量值以及扩展不确定度。9复校时间间隔根据实际使用情况,送校单位可根据实际使用情况自主决定复校时间间隔,建议不超过1年。JJF1817—20205附录A校准用试剂和溶液配制及使用方法A.1纯水:符合GB/T6682规定的一级水。A.4乙二胺四乙酸(EDTA):分析纯。A.5TE缓冲液的配制:用分度值为0.00001g的天平称量1.576g的Tris-HCl,0.292g的EDTA,加入至1L的三角瓶内,向三角瓶内加入700mL一级水,待全部溶解后,调节pH至8.0,然后用1L的量筒定容。A.6校准用标准溶液的配制标准溶液应现配现用。A.6.1示值误差和重复性校准用标准溶液:用TE缓冲液将DNA片段标准物质稀释为2ng/μL的标准溶液。A.6.2线性校准用标准溶液:用TE缓冲液将DNA片段标准物质分别稀释为0.1ng/μL、1ng/μL、4ng/μL、10ng/μL、40ng/μL的系列标准溶液。A.7标准溶液的使用溶液上样量按照被校仪器说明书执行。以12联排管或8联排管模式进样的分析仪,上样量一般为15μL。以12孔芯片模式进样的分析仪,每孔上样量一般为1μL。JJF1817—20206附录B校准原始记录参考格式送检单位:校准日期:年月日仪器名称:制造厂:型号:出厂编号:证书编号:环境温度:℃相对湿度:%气压:kPaB.1片段长度示值误差和片段长度重复性校准记录标准物质名称标准值Cbpbp片段长度测量值bp测量值的平均值 Cbp/bp相对标准偏差RSDB.2浓度示值误差和浓度重复性校准记录标准物质名称标准值Cconng/μL浓度测量值ng/μL测量值的平均值 Ccon/(ng/μL)相对标准偏差RSDB.3线性序号S1S2S3S4S5标准值/(ng/μL)测量值/(ng/μL)相关系数γ校准员:核验员:7附录C校准证书内页参考格式表C.1校准项目和校准结果序号校准项目校准结果1片段长度示值误差测量值:2浓度示值误差测量值:不确定度:(k=2)3片段长度重复性测量值:4浓度重复性测量值:5线性测量值:校准员:核验员:JJF1817—20208附录D浓度示值误差的不确定度评定示例D.1测量方法采用分析仪直接测定DNA片段含量标准物质,并与标准物质的标称值进行比较。D.2测量模型浓度校准结果的示值误差按照式(D.1)计算:ΔCcon=Ccon-Ccons(D.1)式中:ΔCcon—浓度示值误差,ng/μL;Ccon—仪器测量平均值,ng/μL;Ccons—标准物质标称值,ng/μL。在校准过程中环境温度波动控制在小于3℃,因此忽略环境温度的影响。D.3合成标准不确定度计算公式根据测量模型,且输入量Ccon和Ccons之间不相关,所以测量结果的合成标准不确定度按式(D.2)计算:uc=(D.2)D.4不确定度来源不确定度来源包括:a)测量重复性引入的标准不确定度u(Ccon);b)片段含量标准物质引入的标准不确定度u(Ccons);测量重复性和标准物质引入的不确定度不相关,所以合成标准不确定度根据式D.2进行计算。下面以一次分析仪校准为例,具体分析其测量不确定度。在校准中对200bp含量的标准物质测定,结果分别为2.51ng/μL、2.76ng/μL、2.65ng/μL、2.65ng/μL、2.57ng/μL、2.51ng/μL、2.74ng/μL、2.69ng/μL、2.54ng/μL、2.78ng/μL;该片段长度标准物质稀释后的标准物质稀释液的含量标准值为2.85ng/μL±0.08ng/μL(k=2)。D.5标准不确定度一览表标准不确定度一览表见表D.1。D.6标准不确定度评定D.6.1测量重复性引入的标准不确定度u(Ccon)在校准中DNA含量测定结果的值分别为2.51ng/μL、2.76ng/μL、2.65ng/μL、2.65ng/μL、2.57ng/μL、2.51ng/μL、2.74ng/μL、2.69ng/μL、2.54ng/μL、2.78ng/μL,单次测量的实验标准偏差s(xi)为:JJF1817—2020 s(xi)=i-1x)2=0.103(ng/μL)则测量结果平均值的标准不确定度为:u(Ccon)=s(xi)/=0.103/=0.033(ng/μL)D.6.2标准物质引入的标准不确定度u(Ccons)u(Ccons)包含了未稀释的标准物质的不确定度u(Cy-con)和稀释过程引入的不确定度,未稀释的标准物质的不确定度可以根据标准物质证书提供的扩展不确定度U(MS)和包含因子k(Ccon)根据式(D.3)计算:u(Cy-con)=