生物化学-第二章 蛋白质化学-物大分子分离纯化主要方法

生物大分子别离纯化主要方法1/17/20241生物大分子别离纯化的一般步骤

层析法电泳法超离心法超滤盐析〔硫酸铵盐析〕等点电沉淀有机溶剂沉淀透析│←前处理→│←粗分级→│←细分级→│材料选择与处理细胞破碎〔机械破碎、溶涨和自溶、酶解、化学处理〕生物组织→无细胞提取液→粗产品→→结晶1/17/20242盐析法、有机溶剂沉淀法、重金属盐沉淀法、生物碱或酸类沉淀法、加热变性沉淀法离子交换层析吸附层析凝胶过滤〔分子筛〕亲和层析等电聚集层析别离纯化方法沉淀法层析法电学法电泳法等电聚焦透析超滤离心法1/17/20243纯度鉴定分子量测定层析法：凝胶过滤;高效液相色谱法(HPLC)电泳法：PAGE、梯度凝胶电泳、等电聚焦电泳等免疫化学法：专一的沉淀线SDS-PAGE电泳法：测定亚基数超速离心：成分均一其它：如,结晶法……1/17/20244定义：利用半透膜把大小分子分开的方法。操作蛋白质溶液置半透膜袋中，置流动溶剂〔如蒸馏水〕中，使小分子杂质〔如无机盐、单糖、双糖、AA、小肽等透出〕蛋白质留于袋中而得到别离。透析1/17/20245透析工作图半透膜原理1/17/202461/17/202471/17/20248样品在层析时的移动速度可用迁移率Rf值表示：

样品原点到斑点中心的距离

Rf=——————————————样品原点到溶剂前沿的距离1/17/20249(一)层析相关概念1.固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质〔如吸附剂，凝胶，离子交换剂等〕，也可以是液体物质〔如固定在硅胶或纤维素上的溶液〕，这些基质能与待别离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。1/17/2024102.流动相：在层析过程中，推动固定相上待别离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析别离中的重要影响因素之一。1/17/2024113.分配系数及迁移率〔或比移值〕：分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量〔浓度〕的比值，常用K来表示。分配系数是层析中别离纯化物质的主要依据。K=Cs/CmCs:固定相中的浓度，Cm:流动相中的浓度。迁移率〔或比移值〕是指：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用Rf来表示。1/17/202412相对迁移率：是指在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。它可以小于等于1，也可以大于1。用Rx来表示。分配系数主要与以下因素有关：①被别离物质本身的性质；②固定相和流动相的性质；③层析柱的温度。1/17/2024134.分辨率〔或别离度〕分辨率一般定义为：相邻两个峰的分开程度。用Rs来表示。Rs值越大，两种组分别离的越好。当Rs=1时，两组分具有较好的别离，互相沾染约2%，即每种组分的纯度约为98%。当Rs=1.5时，两组分根本完全分开，每种组分的纯度可到达99.8%。如果两种组分的浓度相差较大时，尤其要求较高的分辨率。1/17/2024145.正相色谱与反相色谱正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，因此，在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流出来。反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。一般来说，别离纯化极性大的分子〔带电离子等〕采用正相色谱〔或正相柱〕，而别离纯化极性小的有机分子〔有机酸、醇、酚等〕多采用反相色谱〔或反相柱〕1/17/2024156.操作容量〔或交换容量〕在一定条件下，某种组分与基质〔固定相〕反响到达平衡时，存在于基质上的饱和容量，我们称为操作容量〔或交换容量〕。它的单位是毫摩尔〔或毫克〕/克〔基质〕或毫摩尔〔或毫克〕/毫升〔基质〕1/17/202416数值越大，说明基质对该物质的亲合力越强。应当注意，同一种基质对不同种类分子的操作容量是不相同的，这主要是由于分子大小〔空间效应〕、带电荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响。因此，实际操作时，参加的样品量要尽量少些，特别是生物大分子，样品的参加量更要进行控制，否那么用层析方法不能得到有效的别离。1/17/202417二、层析法分类〔按别离原理分类〕分配层析吸附层析凝胶过滤〔分子筛层析〕离子交换层析亲和层析聚焦层析1/17/202418层析法分类〔按装置分类〕

纸层析薄膜层析

柱层析1/17/202419填充物分部收集玻璃柱洗脱液样品1/17/202420各类层析的原理和载体类别别离原理基质或载体吸附层析化学、物理吸附硅胶、氧化铝、羟基磷酸分配层析两溶剂相中的溶解效应纤维素、硅藻土、硅胶凝胶层析分子筛效应的排阻效应sepharose、sephadex离子交换层析离子基团的交换反响离子交换树脂、纤维素、葡聚糖亲和层析别离物与配体之间有带配基的sepharose特殊亲和力或sephadex聚焦层析等电点和离子交换作用多缓冲交换剂〔与带有多种电荷基团的配体相偶联的sepharose6B〕1/17/202421原理：以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解〔解吸〕，然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。吸附层析〔absorptionchromatography〕1/17/202422吸附层析根据操作方式的不同，分为柱层析和薄层层析两种填充物分部收集玻璃柱洗脱液样品1/17/2024231/17/2024241/17/202425载体：硅胶氧化铝羟基磷灰石应用：别离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸等生化物质1/17/202426原理：分配层析是利用混合物(样品)在二种或二种以上的不同溶剂中的分配系数不同而使物质别离的方法分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相〔展开剂〕。分配层析(p148)1/17/202427物质在纸上移动的速度可以用Rf表示：色斑中心至原点中心的距离Rf=──────────────溶剂前缘至原点中心的距离载体：纤维素硅藻土硅胶应用：各种生化物质的别离鉴定1/17/202428凝胶层析〔gelfiltration〕又称为凝胶排阻层析〔gelexclusionchromatography〕、分子筛层析〔molecularsievechromatography〕、凝胶过滤〔gelfiltration〕、凝胶渗透层析〔gelpermeationchromatography〕等。1/17/202429原理p303凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行别离纯化的。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。1/17/202430载体葡聚糖凝胶〔sephadex〕琼脂糖凝胶〔sepharose〕应用:测定分子量脱盐和浓缩别离提纯生物大分子除去热原物质1/17/202431离子交换层析〔ion-changechromatography〕原理离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行别离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反响共价结合上某种电荷基团形成的。1/17/202432分类：根据交换剂上吸附的离子交换基团不同，阳离子交换剂;阴离子交换剂；按其解离度的大小，分为强、中强、弱三种：

1/17/202433磷酸基团〔PO3H2〕和亚磷酸基团〔PO2H〕结合磺酸基团〔SO3H〕弱酸型

强酸型中等酸型结合酚羟基〔OH〕或羧基〔COOH〕弱碱型

强碱型中等碱型二乙基氨基乙基〔DEAE〕离子交换层析分类阴离子交换剂阳离子交换剂1/17/202434离子交换剂可以分为三局部：(高分子聚合物)基质、电荷基团和平衡离子1/17/2024351/17/202436交换过程2.吸附阶段：样品与反离子进行交换3、4.解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用12345原始缓冲溶液的反离子样品溶液梯度浓度1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合1/17/2024371/17/2024381/17/2024391/17/2024401/17/202441应用

制备、纯化生物物质定量、定性测定混合物中各组分1/17/202442氨基酸分析仪图解缓冲液泵显色反应管茚三酮泵已分开的氨基酸离子交换柱样品注入口记录仪光电倍增管光源1/17/202443原理欲别离的大分产物质S和相对应的专一物质L(配体)以次级键结合，能生成一种可解离的络合物L—S。其中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合，而形成M—L—S复合物。根据L—S之间能可逆地结合与解离的原理开展起来的层桥方法称为亲和层析法。亲和层析〔affiuitychromatography〕

1/17/202444+待纯化分子配体a.待纯化分子和配体间具有亲和性+基质b.活性基质与配体结合产生亲和吸附剂++杂质c.待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d.偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子配体L基质M待别离物质SL-S复合物1/17/2024451/17/202446应用别离纯化酶、抗原、抗体别离纯化核酸研究酶的结构与功能1/17/202447聚焦层析〔Chromatofocusing〕该法是在等电点聚焦方法根底上开展起来的，其别离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。原理1/17/202448pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中，一种样品分次参加时，只要先参加者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚焦，剩余样品还可以加到柱上，其聚焦过程都能顺利完成。1/17/2024491、pH梯度的形成2、蛋白质行为3、聚焦效应1/17/202450层析时的聚焦效应示意图pH梯度溶液的形成示意图蛋白质1（pI=7）蛋白质2（pI=8）流速移动速率1/17/202451几种主要层析方法比较1/17/2024521/17/202453电泳的一般原理

电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极移动的现象。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子组成、性质及其所在介质的pH。如果混合物中各组分的结构组成不同，在某一pH溶液中，各组分所带电荷性质、电荷数量不同，加之其分子量不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，而到达别离鉴定各组分的目的。1/17/202454电泳分类1/17/2024551/17/202456〔三〕按支持介质形状不同1.薄层电泳；

2.板电泳；

3.柱电泳。〔四〕按用途不同可分为：

1.分析电泳；2.制备电泳；

3.定量免疫电泳；1/17/2024571/17/202458

纸电泳

薄膜电泳

凝胶电泳

毛细管电泳1/17/202459毛细管电泳1/17/202460三、影响电泳的因素〔一〕带电颗粒的物理性状〔二〕支持物介质：〔三〕缓冲溶液(pH离子强度)〔四〕电场强度：〔五〕电渗现象：〔六〕焦耳热对电泳的影响1/17/202461I=1／2ΣCZ2(式中：I为离子强度，C为离子的摩尔浓度，Z为离子的价数)。1/17/2024621/17/2024631/17/202464凝胶聚合反响及催化系统不连续PAGE可产生的三种效应：电荷效应、分子筛效应、浓缩效应1/17/2024651/17/202466光聚合催化剂是核黄素，核黄素在光照下能够产生自由基，催化聚合反响。聚合方式1/17/202467SOeSOSO282424----·+®+RMMRMM··+®RMRM··+®RMMMRMMM··+®1/17/202468

1/17/202469不连续表现：缓冲液及凝胶pH不连续凝胶孔径不连续电位梯度不连续1/17/202470⊕–电极缓冲液pH8.3

Tris-Gly

别离胶pH：8.9Tris-HCl电极缓冲液pH8.3Tris-Gly

浓缩胶pH：6.7Tris-HCl

样品

1/17/2024711/17/2024721/17/202473SDS

原理：当SDS〔SodiumDodecylSulfate〕与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差异就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在SDS的作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。可用下式表示：LogM=a–b应用:测定蛋白质分子量测定蛋白质亚基数1/17/202474SDSseparatesproteinsbyMW1/17/2024751/17/2024761/17/2024771/17/202478等电点聚焦〔isoelectricfocusing〕

原理:在一定抗对流介质〔如凝胶〕中参加两性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各自相异却又相近〕，当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其等电点相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到别离。应用：高效率别离纯化蛋白质测定蛋白质分子量1/17/2024791/17/202480等电聚焦电泳法测定蛋白质pI1/17/2024811/17/202482毛细管电泳毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管〔2-75μm〕中装入缓冲液，从其一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电实现对样品的别离，别离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。该法克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效别离。1/17/202483毛细管电泳装置示意图高压电源光源光电倍增管数据采集毛细管缓冲液-样品缓冲液1/17/202484离心原理离心机分类离心根本方法1/17/202485原理：离心法是利用离心机产生的强大离心力来别离具有不同沉降系数的物质。沉降系数〔S〕概念1/17/202486沉降系数〔S〕

生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。其单位用Svedberg，即S表示，S=1×10-13秒。

沉降系数〔S〕与分子量〔M〕的关系M=RTSD(1-

)Svederg方程:1/17/202487沉降系数〔S〕

生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。其单位用Svedberg，即S表示，S=1×10-13秒。

沉降系数〔S〕与分子量〔M〕的关系M=RTSD(1-

)Svederg方程:1/17/202488分析性离心机制备性离心机工业用离心机实验用离心机按用途普通离心机<6000rpm高速冷冻离心机20000～25000rpm超速离心机50000～80000〔大于30000〕rpm工业用离心机实验用离心机1/17/202489组成：主机、转头和离心管1/17/202490离心根本方法沉淀离心：差速沉降离心法：密度梯度区带离心法：差速区带离心法等密度区带离心法1/17/202491沉淀离心(pelletingcentrifugation)一般是指介质密度约为1g/ml，选用一种离心速度，使悬浮溶液中的悬浮颗粒在离心力的作用下完全沉淀下来，这种离心方式称为沉降离心。主要适宜于细菌等微生物、细胞和细胞器等生物材料(密度在1.08～1.12g/ml左右)及病毒和染色体DNA(密度在1.18～1.31g/ml左右)等的离心别离。沉降离心与离心力和颗粒大小有关1/17/202492差速沉降离心：采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批别离的方法。此法一般用于别离沉降系数相差较大的颗粒。1/17/202493密度梯度区带离心法〔简称区带离心法〕：区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的别离方法。此法的优点是：①别离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能象差速离心法一样别离具有沉降系数差的颗粒，又能别离有一定浮力密度差的颗粒；图2-11速率区带离心示意图骤③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。1/17/202494当不同的颗粒间存在沉降速度差时〔不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差〕。在一定的离心力作用下，颗粒各自以一