转基因水稻和马铃薯植株表达人类细胞色素P450

转基因水稻和马铃薯植株表达人类细胞色素P450通过对除草剂解毒作用显示交叉耐药性YasunobuOhkawaandHideoOhkawa1植物生物技术系农业生物资源研究所日本筑波305-86021农学专业神户大学日本神户657-8501［摘要］转基因植物可以表达不同种类的解毒酶，例如取自哺乳动物的细胞色素P450S单加氧酶，它们是通过农杆菌介导转化而得。这类转基因植物对外源化学物质产生一系列化学变化，包括对除草剂产生耐药性。因为这类酶具有广泛的底物特异性，所以尽管它们有着不同的作用机制和化学结构，转基因植物对许多种除草剂仍然产生了交叉耐药性。有耐药性的植物可被用于除草剂的轮作制，以避免或者延迟杂草向对除草剂产生耐药性进化。这种转基因植物也有望被用于降低农药对农田环境的影响。［关键词］细胞色素P450，解毒，抗除草剂，转基因植物，植物修复，杂草管理引言近年来，越来越多公司商业化培育种植抗除草剂转基因作物。目前世界上培育的主要的转基因农作物是大豆和玉米，其原理是携带了5-烯醇丙酮莽草酸-3磷酸(EPSP)合酶基因或者细菌膦乙酰转移酶(PAT)基因(James2000,Ohkawaetal.1999)。尽管适当使用除草剂使得杂草的管理更加容易，但是重复的使用除草剂往往会诱导杂草对除草剂的耐药性迅速发展(Benbrook1999)。其中一种延迟该抗性性进化的策略是交替使用除草剂，这种方法在许多年前已经被作为最有效的方法提出(Putwain1990)。细胞色素P450(或CYP)酶包含在植物的除草剂代谢机制中，P450联合NADPH-细胞色素P450氧化还原酶(还原酶)以及某些除草剂发生脂溶性化合物催化氧化反应(图1)。这些各种细胞色素P450在除草剂的选择耐药性中有着重要的作用(Werck-Reichhartetal.2000)。然而，因为在一个庞大的基因家族中鉴定各种细胞色素P450的功能很困难，比如说，拟南芥就有将近300多种P450(Ohkawaetal.1999)，所以这些P450的分子信息很有限。另一方面，哺乳动物肝脏微粒中的P450种类分子机制作为药物代谢酶已经被研究的很深。这些P45参与氧化代谢异源物质包括除草剂，由于哺乳动物细胞色素P450中有一种显示高效的除草剂代谢活性和广泛的底物特异性(Ohkawaetal.1999)，我们才生产出能表达哺乳动物的细胞色素P450的马铃薯和水稻品种。P450NADP+P4E0ePRPFMNeP450P45OMUfiH4-0Srqotqfl=tCf&QQQOfljQftpL㈡口口P450NADP+P4E0ePRPFMNeP450P45OMUfiH4-0Srqotqfl=tCf&QQQOfljQftpL㈡口口QgiQCip口appnpaQpQQPQQQPQ/QSQgQ'P斗£0还原酶NADFHROH+H20图1 植物微粒体中细胞色素P450单加氧酶(Ohkawaetal1998)图经过稍许翻译处理转基因马铃薯表达产生出人类细胞色素P450酶并使得对除草剂产生耐药性CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C18、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1与CYP3A4这11种细胞肝脏中的细胞色素P450已经被报道，90%以上的药物P450依赖性代谢机制中有它们的存在。我们检测了重组酵母菌株的微粒体表达的11种P450,发现50次除草剂测试中有27次代谢反应中其主要代谢物质为CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C18、CYP2C19、CYP2D6以及CYP3A4。一种除草剂由不同种和亚种细胞色素P450代谢，而每种细胞色素P450可以对不同类别的除草剂发生代谢反应(Inuietal.2001)。根据上述结果，属于不同种类和亚种的3种主要细胞色素P450，如CYP1A1、CYP2B6和CYP2C19被选择并通过农杆菌介导方法导入马铃薯植株中(Solanumtuberosumcv.MayQueen)。插入人类CYP1A1、CYP2B6和CYP2C19cDNA的表达质粒pUHA1、pUHB6和pUHC19中，并分别导入质粒pUTR121H中。来自pBI121的质粒pIKBAC也是因为三个表达单元的插入而共表达出CYP1A1，CYP2B6和CYP2C19三种色素(图2)。

HE1CYP1A11CYP2B6pIKEACCYP2C19LBWHE1CYP1A11CYP2B6pIKEACCYP2C19LBWpUHA1PUHB6PUHC19图2表达出人类CYP的构建质粒的结构（Inuietal2000）经过了卡那霉素抗性选择、PCR分析、7-乙氧基香豆-O-脱甲基法分析（CYP1A1活性的标准测定）以及免疫印记共四种联合分析，在转基因植物基因组中相应基因的存在以及它们的表达已经被Southern、Northern和Western免疫印记杂交分析证实。四种转基因马铃薯植株S1965、S1972、S1974和T1977表达出CYP1A1和CYP2B6，CYP2C19，并且这三种细胞色素最终被分别筛选出来。喷洒除草剂到种植转基因植物的花盆里后的8到15天，对除草剂有耐药性的转基因土豆被做出检测。T1977植物对光合作用抑制除草剂如阿特拉津除草剂（AT）、绿麦隆除草剂（CT）和甲基苯噻隆除草剂（MT）显示耐药性。比较来说，没有转基因的马铃薯植株，如“MayQueen—五月皇后”植株就很容易被除草剂杀死（图3）。尽管T1965号植株也对绿麦隆除草剂（CT）和甲基苯噻隆除草剂（MT）产生耐药性，S1974植株对阿特拉津除草剂（AT）有轻微的耐药性，S1972植株很容易受到这些除草剂的影响。但是转基因植株T1977、S1972、S1974对蛋白质合成抑制除草剂如乙酰氯除草剂（AC）、异丙甲草胺杀虫剂（MC）都产生耐药性。然而，“MayQueen”植株以及S1965植株容易受到除草剂的影响引起顶芽枯萎或者是根本就不发芽。此外，T1977和S1965对抑制类胡萝卜素的生物合成除草剂如哒草伏除草剂（NR）有高度耐药性，但是“MayQueen”植株以及其他的转基因植株的心尖部位完全变白。尽管“MayQueen”植株以及其他的转基因植株易受到感染并且根伸长生长迟缓，但是转基因植株T1977被脂类生物合成抑制除草剂处理如piributicarb（PC）（—种除草剂名字，未找到翻译中文名称）后，植株仍根伸长并正常生长。

图3T1977植株对许多不同机制、不同结构的除草剂进行耐药性测试依据这些结果,T1977表达了三种人类细胞色素P45O：CYP1A1和CYP2B6和CYP2C19,并高度体现了对不同反应机制和化学结构的除草剂的交叉耐药性。S1965转基因马铃薯植株仅仅只表达了一种P450细胞色素CYP1A1，这种细胞色素对1,3,5三嗪除草剂MT、苯基脲除草剂CT、哒嗪酮除草剂NR有耐药性。S1972表达出的CYP2B6以及S1974表达出的CYP2C19也分别对乙酰氯苯胺除草剂AC和MC，AT、AC、和MC除草剂有耐药性。在T1977中，这三种P450被认为相互联合使得对PC除草剂产生耐药性，如果转基因马铃薯植株中仅表达出一种P450，这种PC除草剂将抑制根部的伸长和生长,S1965,S1972和S1974也一样(Inuietal.2000)。含有人类细胞色素P450酶的转基因马铃薯植株中除草剂的代谢机制取自重组酵母菌株的微粒体表达的CYP1A1代谢反应AT除草剂(Inuietal.2001),这种表达出CYP1A1的转基因马铃薯对AT除草剂产生耐药性。在CYP1A1马铃薯植株中的AT除草剂的代谢机制之后通过薄层色谱(TLC)分析，发现用14C标记的AT除草剂加入营养液后迅速的被带入植株中，从植物中提取的14C的标记的代谢产物通过薄层色谱(TLC)分析后，四种代谢成分被发现，其中两种被鉴定为DI和DIDE代谢产物。然而以前的研究发现在抗AT除草剂的小麦中的DE(Lamoureuxetal.1973)既没有在这些转基因植物也没有在未转基因植物中发现。培养8天后，无毒的DIDE在CYP1A1马铃薯植株中的量是未转基因植株的五倍(表1)。薄层分析起始处显示未知的化合物(UK2)的数量显示在CYP1A1马铃薯植株中比在未转基因植株中高。AT/代谢物代谢物产量(顷肛/植物阳天)未转基因MayQuE相植株 CYP1A1转基因马铃■薯植株AT3.0+1.32.6+0.9□1O.B+0.41.1+0.2UK10.6±0.10.S+0.2□IDE0.2±0.110+0.3UK2O.B±0.312+0.3表1转基因马铃薯植株中14C标记的阿特拉津除草剂的代谢机制(Inuietal1999)UK1：未知代谢物1 UK2:未知代谢物2从这些数据中得出，转基因马铃薯表达的CYP1A1被发现可以代谢AT除草剂，且代谢反应的量比在未转基因马铃薯植株中更多，它主要是通过N-DI和N-DIDE产出无毒的代谢产物。在高粱中发现，抗AT除草剂的植物主要的代谢途径是谷胱甘肽(GSH)结合(Lamoureuxetal.1973)。N-DI也曾研究发现其与谷胱甘肽结合作用比与1,3,5-三嗪对耐药性影响强。然而，DIDE代谢物的积累，似乎对于转基因CYP1A1马铃薯植株对AT除草剂产生耐药性有着重要作用，因为它可能是通过先DI后DE途径代谢AT除草剂产生DIDE，其DIDE产量是未转基因植株的5倍，如图4。因此，高耐药性的CYP1A1马铃薯植株可能对CYP1A1马铃薯植株形成DIDE代谢物有着绝对的影响。

N小麦NHN:H.NHJC.H.HN转基因马铁蓉植株匚屮曲、"NHzDI部分有垂NHCHCCH^AT-GSH【高粱N小麦NHN:H.NHJC.H.HN转基因马铁蓉植株匚屮曲、"NHzDI部分有垂NHCHCCH^AT-GSH【高粱ClM/k^N阿特拉津 7DIDE无垂TransgenicpotatokNHCH^CH3I2DE部分有垂图4在高等植物中的阿特拉津除早剂的王要代谢途径(Inuietal1999)转基因水稻表达产生出人类细胞色素P450酶并使得对除草剂产生耐药性五种主要的细胞色素P450种类：CYP1A1、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C18和CYP2C19它们属于不同的种类或者亚种并被筛选和导入水稻植株中(OryzasativaL.var.Nipponbare)。P450表达质粒的结构如图5，这些质粒如pIES1A1、pIJ2B6、pIJ2C9、pIES2C9、pIJ2C18、pIES2C18、pIJ2C19、pIES2C19由插入人类P450cDNA的pIG121Hm构建。转基因水稻植物是通过PEG介导转入或者是农杆菌介导法转入形成(Hieietal.1994)。经过潮霉素的选择,从再生水稻植株的叶子中提取的基因组DNA，经过PCR和Southern印记杂交分析确定了P450cDNA的存在。转基因水稻的R1种子被播撒到含有适量除草剂的土壤中，以筛选表达出P450细胞色素酶的植株。筛选出的转基因水稻被命名为CYP1A1水稻、CYP2B6水稻等等。图5人类CYP重组构建表达质粒结构（Hiroseetal1999）一般来说，成熟的植株比发芽的种子和幼苗更有抗除草剂能力。CYP水稻植株曾栽培在含有适当的除草剂的MS培养基中进行发芽试验测试以检测其除草剂耐药性。取自于纯合子的CYP2B6水稻的R2种子被播撒进含有六种除草剂的培养基中，这些除草剂已经是被来自重组酵母植株的微粒体表达的CYP2B6体外代谢过。所有的种子显示出对蛋白质生物合成抑制除草剂如MC、AC和草不绿除草剂（AL）以及细胞分裂抑制除草剂如氟乐灵除草剂（TF）有高度的耐药性。另一方面显示，为转基因的水稻既没有在含有MC、AC或者是AL除草剂的培养基中发芽，也没有在含有TF除草剂的培养基中发芽（图6）。CYP2B6水稻也对蛋白质生物合成抑制除草剂如苯噻草胺除草剂（MF）和光合作用抑制除草剂如氯草敏有轻微的耐药性。表达出CYP2C19的转基因种子R1被播撒在含有10中除草剂的培养基中，对其中5种除草剂有耐药性，它们分别是CT、PM、NR、MF和PC（表2）。CYP1A1水稻对光合作用抑制除草剂CT和NR、细胞分裂抑制除草剂MF以及醋酸基辅酶A碳酸酵素抑制除草剂喹禾灵（QE）都有着耐药性。CYP2C9水稻对支链氨基酸生物合成抑制除草剂如氯磺隆除草剂（CS）以及唑吡嘧磺隆除草剂（IS）有耐药性。然而，CYP2C18水稻在实验中没有显示出对除草剂有明显的耐药性。

11CY甲氧垂草安印时乙草胺lilM氟乐灵1吐砧11CY甲氧垂草安印时乙草胺lilM氟乐灵1吐砧<¥P!hWNcvrjiijfl0J1M草不绿Z冲显*w0口M 氯草敏300PM 苯噬草胺1.SUM图6CYP2B6水稻对除草剂的耐药性除草剂类别 -CyP2B6CYP2C19酵母水稻酵母水稻光合作用抑制剂ChloridazonPyridazinone19+S+dilortoluron支琏氨基酸生物合成抑制剂Phenylurea+36++Pyriminobac-meihyl类胡萝卜素生物合成抑制剂Pyrimidinyloxybenzaic±86++Norfiu『吕工©n蛋白质生物合成抑制剂Pyridazinone++83+++AcetochlorChHoroacetoanilide42+++15NDAlachlDrChlo『oacetcanilide18+++NDMetoHachlorCliloroscetoanilide17+++43+ThenylchlorChlo『omcmtoEnilideND+++ND+PretiilachlorChlo『oacetcanilideND+++ND+Butachloir细胞分裂抑制剂ChHoroacetoanilideNDNDMefenacetOxvacet日made6+25++Trifluralin脂类生物合成抑制剂2,6-dinrtroaniliine5++NDPyributicarbThiocarbamate17++表2CYP2B6水稻和CYP2C19水稻对除草剂的耐药性酵母一栏中的数字表示来自转基因酵母的微粒体的代谢百分比；水稻一栏中的“+”表示对除草剂的耐药性(Ohkawaetal.2000,Inuietal.2001)+++：生长情况与在无除草剂培养基中培养一样++：生长情况优于对照组（非转基因）植株+：部分生长情况优于对照植株±： 部分生长情况略微优于对照植株-： 没有生长ND：不确定转基因水稻植株表达的人类细胞色素P450种类对大部分的除草剂有耐药性，相应的在酵母微粒体外代谢中表达出细胞色素P450O然而在某些情况下，如CYP2C18水稻，这种转基因水稻植株并没有对除草剂显示出耐药性，这可能是因为其体外表达出的P450酶的活性低的缘故。尽管有些例外，但是除草剂的催化实验中，取自重组酵母菌菌株的微粒体表达的细胞色素P450酶表明在转基因水稻植株对相应的除草剂可能有耐药性。采用不同类别的除草剂如乙酰氯苯胺除草剂MC、AC和AL；氧乙酰胺除草剂MF；2,6-二硝基苯胺除草剂TF；氯草敏除草剂和哒嗪酮除草剂NR；硫代氨基甲酸盐除草剂PC；2-（4-芳氧苯氧）羧酸类旋光性除草剂QE；硫酰脲除草剂IS进行测试，结果累死转基因马铃薯一样，转基因水稻表达出的人类细胞色素P450表达出对不同种类、作用机制除草剂的耐药性。含有人类细胞色素P450酶的转基因水稻植株中除草剂的代谢机制采用14C标记乙基丙草胺除草剂进行TLC薄层分析法来探究CYP2B6水稻纯合子R3的后代的代谢途径。两个14C标记的代谢物：乙基丙草胺和可能的共轭化合物在TLC薄层分析起始阶段被发现。乙基丙草胺主要在培养基中而不是在植株中被发现，而共轭化合物是在植株中发现。在几天之内，乙基丙草胺迅速被CYP2B6水稻代谢成为脱甲基形式，但是潜伏期后3天，20%以上的乙基丙草胺存在于没有转基因的日本晴（nipponbare）超级杂交稻中。乙基丙草胺在进一步分解之前似乎是迅速分泌到培养基中（图7）o

起始处起始处图7乙基丙草胺和培养基中代谢物的相对数量变化植物中剩余的乙基丙草胺以及培养基中的乙基丙草胺经过气相色谱仪和质谱仪分析，仅仅一部分乙基丙草胺在植物中被探测到，而大部分的乙基丙草胺存在于培养基中，乙基丙草胺的摄取被认为很低。然而，CYP2B6水稻会降低本该增长的乙基丙草胺的含量，并迅速分泌代谢物，培养基中的乙基丙草胺的含量增长的很快。CYP2B6水稻植株中的乙基丙草胺的降解速度约为未转基因日本晴(nipponbare)超级杂交稻的1.4倍。这些结果表明在体外促成的水稻CYP2B6的表达在除草剂等异型生物质的途径对催化化学化合物有着高效的活性与潜力。结论转基因马铃薯和水稻植株表达的人类细胞色素P450酶能够降解不同作用机制和化学结构的除草剂。因为它能够解毒的原因，转基因植物对于许多除草剂有着交叉耐药性。尽管大部分农作物仅对一种特殊的除草剂有耐药性，但是有着人类细胞色素P450酶转基因植物却显示着交叉耐药性并且预计可能轮流交替对不同除草剂产生耐药性。转基因植物以及不同的除草剂轮流组合将可以有助于防止杂草突变产生对除草剂的耐药性。转基因马铃薯和水稻植株在培养基中先吸收除草剂，然后分解它们。有些除草剂，例如西玛津除草剂存在于土壤中并持续一段时间的有效作用。西玛津是一种含有阿特拉津1,3,5三嗪除草剂，并被人类CYP1A1酶降解。因此，转基因CYP1A1马铃薯和水稻应该能够从土壤中除去残留西玛津以促进其降解。这些转基因植株表达的P450酶也预期可用于植物修复中发挥作用。参考文献Benbrook,C.1999.EvidenceoftheMagnitudeandConsequencesoftheRoundupReadySoybeanYieldDragfromUniversity-BasedVarietalTrialsin1998.AgBioTechInfoNetTechnicalPaperNo.1.Ecologic.Inc.,Sandpoint,Idaho,U.S.A.().Funae,Y.,N.ObataandS.Kirigami.1998.MultiplefunctionofcytochromeP450.KanTanSui37:91.(InJapanese).Hiei,Y.,S.Ohta,T.KomariandT.Kumashiro.1994.Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.PlantJour.6:271-282.Inui,H.,Y.Ueyama,N.Shiota,Y.OhkawaandH.Ohkawa.1999.Herbicidemetabolismandcross-toleranceintransgenicpotatoplantsexpressinghumanCYP1A1.PesticideBiochemistryandPhysiology64:33-46.Inui,H.,T.Kodama,Y.OhkawaandH.Ohkawa.2000.Herbicidemetabolismandcross-toleranceintransgenicpotatoplantsco-expressinghumanCYP1A1,CYP2B6andCYP2C19.PesticideBiochemistryandPhysiology66:116-129.Inui,H.,N.Shiota,Y.Motoi,Y.Ido,T.Inoue,T.Kodama,Y.OhkawaandH.Ohkawa.2001.MetabolismofherbicidesandotherchemicalsinhumancytochromeP450speciesandintransgenicpotatoplantsco-expressinghumanCYP1A1,CYP2B6andCYP2C19.Jour.PesticideScience26:28-40.James,C.2000.GlobalStatusofCommercializedTransgenicCrops:2000.ISAAABriefsNo.21:Preview.TheInternationalServicefortheAcquisitionofAgri-biotechApplications,Ithaca,NY,U.S.A.().Lamoureux,G.L.,E.Stafford,R.H.ShimabukuroandR.G.Zaylskie.1973.Atrazineme