《基因工程》第一章 概论

基

因

工

程基因工程第一章概论第二章

基因工程的基本原理第三章

基因工程所需的基本条件第四章基因工程的操作过程第五章

目的基因的克隆与基因文库的构建第六章

大肠杆菌基因工程第七章

酵母基因工程第八章疫苗的研究第九章

高等植物基因工程第十章哺乳动物基因工程基本要求：掌握基因克隆的基本工具。特别是不同的载体。克隆基因的基本方法。怎样利用基因重组技术研究基因的结构、表达和调控。利用基因工程生产重组蛋白，基因工程在医药和农业上的应用。能够设计一个基因克隆的程序。PCR技术基本原理和应用能够根据酶切结果判读酶切图谱，以及判读DNA序列的能力。考核方式平时成绩10分（考勤5、参与问卷调查5）模拟申请项目书40分(2011年12月4日之前交)期末考试50分（开卷）

模拟申请项目书要求：1、根据自己的知识背景和现在的工作，结合“基因工程”课所学的知识，设计一下自己的硕士研究生课题。2、具备前沿性、可行性、创新性。3、模板见下页。一、课题基本信息：题目、摘要、关键词二、报告正文：参照以下提纲撰写，要求内容翔实、清晰，层次分明，标题突出。（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。（此部分为重点阐述内容）拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）本项目的特色与创新之处。年度研究计划及预期研究结果。（二）研究基础与工作条件1、工作基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）2、工作条件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家实验室、国家重点实验室和部门重点实验室等研究基地的计划与落实情况）3、申请人简介（包括申请人和项目组主要参与者的学历和研究工作简历，近期已发表与本项目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务。论著目录要求详细列出所有作者、论著题目、期刊名或出版社名、年、卷（期）、起止页码等；奖励情况也须详细列出全部受奖人员、奖励名称等级、授奖年等）4、承担科研项目情况（申请人和项目组主要参与者正在承担的科研项目情况，包括自然科学基金的项目，要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年月、与本项目的关系及负责的内容等）5、完成科学项目情况（对申请人负责的前一个已结题科研项目（项目名称及批准号）完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作总结摘要（限500字）和相关成果的详细目录）第一章概论一基因工程与生物工程的关系二基因工程的基本定义三基因工程的基本形式四生物（工程）技术的其他内容五基因工程的发展史六基因工程的生物安全性七基因工程的意义生物工程：也叫生物技术，是生物科学与工程技术有机结合而兴起的一门综合性科学技术。一基因工程与生物工程等的关系特点：

以生物科学为基础，运用先进的科学原理和工程技术手段来加工或改造生物材料，如DNA、蛋白质、染色体、细胞等，从而生产出人类所需要的生物或生物制品。基因工程细胞工程发酵工程酶工程蛋白质工程生物（工程）技术的内容：重组DNA技术(recombinantDNAtechnique）基因工程（GeneEngineering）遗传工程（GeneticEngineering）基因克隆（genecloning）分子克隆（MolecularCloning）基因操作（genemanipulation）二基因工程的基本定义

重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。二基因工程的基本定义

基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。三基因工程的基本形式第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程四生物（工程）技术

的其他内容：细胞工程发酵工程酶工程蛋白质工程细胞工程

(cellengineering)按人们的设计，有计划地改变或创造细胞的遗传性状，在体外大量培养和繁殖细胞群体、生物个体或株系。内容：细胞融合，细胞拆合，染色体转移，基因转移，细胞或组织培养，细胞移殖，细胞重组，细胞杂交瘤等。酶工程

(enzymeengineering)利用重组DNA技术,根据酶所特有的生化催化特性，在常温常压下生产酶反应产品或酶纯化的工艺。。内容：酶反应器，酶分子修饰，酶的全人工合成，酶的固定化。又称生化工程微生物工程,又称发酵工程(fermentationengineering)从自然界中筛选或诱变育种获得菌种。基因工程技术构建工程菌。内容：菌种选育，代谢途径，调控机制研究，高密度发酵，生产各种产品。蛋白质工程

（proteinengineering）

蛋白质工程就是根据蛋白质的精细结构与功能之间的关系，利用基因工程的手段(包括基因的定点突变和基因表达)，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。我国的蛋白质工程具有国际先进水平，产品包括重组人胰岛素和溶血栓药物，重组人尿激酶等。

蛋白质工程的研究内容

通过改变蛋白质的活性部位，提高其生物功效；通过改变蛋白质的组成和空间结构，提高其在极端条件下的稳定性，如酸、碱、酶稳定性；通过改变蛋白质的遗传信息，提高其独立工作能力，不再需要辅助因子；通过改变蛋白质的特性，使其便于分离纯化，如融合蛋白ß-半乳糖苷酶（抗体）；通过改变蛋白质的调控位点，使其与抑制剂脱离，解除反馈抑制作用等。研究中通常采用的方法

在蛋白质分子中引入二硫键以提高蛋白质的稳定性；减少半胱氨酸残基数目以避免错误折叠的可能性；置换天冬酰胺、谷氨酰胺或其他氨基酸，以修饰酶的催化特异性或增加酶的活性等。定向诱变：

在DNA水平上改变氨基酸的编码序列的过程，称作定向诱变。定向诱变的方法：

1.利用M13DNA进行的寡核苷酸定向诱变；2.利用质粒DNA进行的寡核苷酸定向诱变；3.PCR扩增进行寡核苷酸定向诱变；4.利用简并寡核苷酸引物随即诱变；5.DNA重排等等。蛋白质工程与基因工程的区别

基因工程是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内，并在其中进行表达，它的产品还是该基因编码的天然存在的蛋白质。蛋白质工程则更进一步根据分子设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对其所编码的蛋白质的改造，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的，具有人类需要的优点的蛋白质。蛋白质工程↑基因工程→工程菌构建、改造→微生物工程→生化工程→产品↓细胞工程→细胞株、组织、器官→生物新品种→酶工程

本课程的地位：现代科技革命高新技术生物技术(工程)基因工程基因克隆五基因工程的发展史1.

理论上的三大发现证明了生物的遗传物质是DNA（基因工程的先导）DNA的双螺旋结构和半保留复制机理遗传信息的传递方式（中心法则）2.

技术上的三大发现60年代末－70年代初，限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）载体的使用1970年，逆转录酶的发现。五基因工程的发展史3．基因工程诞生

72年P.Berg研究组（美国斯坦福大学）(与W.GilbertandF.Sange获得1980年诺贝尔化学奖)完成世界上第一个体外重组DNA

对(SV40+λphage)DNA→EcoRI ↓T4ligaseSV40λ重组分子1973年S.Cohen（美国斯坦福大学）和N.Boyer完成第一个细菌克隆1974年异源真核生物基因在Ecoli中表达

S.Cohen,H.Boyer用非洲爪蟾的编码核糖体基因

pSC101重组导入Ecoli

分析转化子：在Ecoli细胞内有外源的mRNA转录产物

五基因工程的发展史1973年，Cohen等获得了抗四环素和新霉素的重组菌落TcrNer，标志着基因工程的诞生。Tetracycline

pSC101EcoRIT4DNALigaseKanamycin

R6-5Kanr

andTetrpSC101完整，R6－5部分五基因工程的发展史五基因工程的发展史4.发展过程中的重大事件1977年，E.coli中合成了人生长激素基因。1978-1979胰岛素基因在大肠杆菌中表达。1982年，培育出了超级鼠。1985年Horsch发明了植物基因工程的基本方法：叶圆盘法，并获得转基因植株。4.发展过程中的重大事件1990年，患有遗传免疫疾病的4岁女孩接受了基因疗法。1990年，Perlak将B.T.基因导入棉花获得抗虫棉。1991年，美国开始人类基因组计划。1997年，“多利”绵羊诞生。（体细胞核移植）

1998年胚胎干细胞2005年韩国科学家黄禹锡培育第一只克隆狗2009年12月2日美国首批胚胎干细胞获得合法“许可证”五基因工程的发展史转移大鼠生长素基因的小鼠1．基因工程问世后国际科学界的高度重视六基因工程的生物安全性科学界第一反应→禁止有关实验进行1971年6月冷泉港生物学会议上，引起人们的注意1972年欧洲分子生物学实验室（EMBO）：工作会议1973年Gordon会议1974年1月Berg筹备了一个小型讨论会，4月份在麻省理工学院召开

2.

委员会提出如下四点建议：暂停两类实验：

1）涉及自然界中尚未出现的有病毒生产能力或带有抗菌素抗性基因的质粒。

2）涉及将肿瘤病毒或其他动物病毒的DNA进行连接重组的实验。对将动物DNA和质粒或噬菌体DNA连接重组的实验要慎重。呼吁美国卫生研究院（NIH）成立重组DNA咨询委员会（recombinantDNAadvisorycommittee，RAC）在1975年召开一次国际会议:研究如何对待重组DNA分子带来的可能危害.六基因工程的生物安全性1975.2.24-27美国卫生研究院（NIH），在美国召开会议，160名来自美国和其他16个国家的专家提出相应规定。1972－1976科学家们对

①载体－受体进行有效的安全性改造

②严格实验的材料和范围

③严格实验室和操作人员的规范

3.

委员会继续努力：六基因工程的生物安全性1976年美国NIH发布《重组DNA分子研究准则》国际经济发展合作组织颁布了《生物技术管理条例》欧美也颁布了《关于控制使用基因修饰微生物的指令》《关于基因修饰生物向环境释放的指令》1986年6月，美国发布《生物技术法规协调大纲》1996年联合国环境署和《生物多样性公约》秘书处就《生物安全协议书》组织了9轮谈判。

4.各国政府和国际社会对生物安全性的认识和行动

六基因工程的生物安全性2001年

布什政府颁布关于干细胞研究的限制令

2009年3月奥巴马宣布取消布什政府所设的干细胞研究限制令

2009年12月2日，13株胚胎干细胞系通过美国NIH审核，成为首批合法干细胞系。

乔治.戴利在美国波士顿儿童医院拥有一所自己的实验室。12月2日，NIH公布的干细胞系，11/13株来自该室。地方法院推翻美国总统令宗教组织与科学界激烈争论美国胚胎干细胞研究争议再起

美国哥伦比亚特区地方法院法官罗伊斯·兰伯思8月23日做出一项裁决，推翻了美国总统奥巴马去年放宽人类胚胎干细胞研究的总统令。裁决认为，胚胎干细胞研究破坏胚胎，联邦资金资助属于违法

1996年美国国会通过的《迪基—威克修正案》，该修正案禁止联邦资金资助制造或破坏人类胚胎的研究活动。

1999年克林顿政府创造性地绕开了修正案规定，提出资助胚胎干细胞、特别是由私人研究所提取出的胚胎干细胞研究，不属于“资助破坏胚胎的活动”。2001年8月，布什签署总统令，禁止联邦资金用于提取胚胎干细胞及其研究，只能对当时已有的21种胚胎干细胞展开研究。奥巴马则扭转布什旧规，在去年3月9日签署总统令，宣布扩大联邦资金用于胚胎干细胞的研究。兰伯思的裁决实际上否定了这三任政府的所有解释。他在长达15页的判决书中说，干细胞和胚胎密不可分，只要是胚胎干细胞研究，就一定存在破坏胚胎的情况。在《迪基—威克修正案》里，“国会行文的一致意向，是禁止联邦资金用于制造或破坏胚胎的研究活动”。他说，如果国会有意认可某些胚胎干细胞研究，会在法案中明文指出。“但法案没那么写，法庭必须遵照成文法”。

“判决是对美国生物医疗研究一次令人目瞪口呆的重击”

胚胎干细胞是具有最广泛发展潜力的干细胞，可以分化成所有种类的体细胞。虽然胚胎干细胞的效用还不能完全确定，但科学家们相信，有朝一日他们能培育出全新的细胞和组织，为治疗糖尿病、心脏病、癌症、帕金森氏综合征等疾病提供新方法。由于胚胎干细胞研究会破坏胚胎，这项研究在美国引起道德和伦理方面的争议。干细胞系：是指一群干细胞的集合。以一个胚胎干细胞为基础，实验室将这枚细胞分裂增殖，生长成大量、同质的胚胎干细胞，这群干细胞就是一株干细胞系。培育一株干细胞系很不容易，因为胚胎干细胞很容易发育成具有特殊功能的体细胞，失去干细胞特有的“全能”生长潜力。我国：1993年12月24日发布17号令《基因工程安全管理办法》1996年7月农业部发布《农业生物基因工程安全管理实施办法》1996年由国家环境组织代表团（外交部、科技部、外经贸部、农业部、中科院，）参加了《生物安全协议书》缔约工作，我国为第70个签署国。

5.我国政府对生物安全性的认识和行动

六基因工程的生物安全性6生物安全性评价：目的：从技术上分析生物技术和产品的潜在危险、确定安全等级、制定防范措施、防止潜在危害。主要作用：提供科学决策依据保障人类健康与环境安全性回答公众疑问促进国际贸易、维护国家权利促进生物技术的发展六基因工程的生物安全性7.生物安全性分级标准

基因工程工作安全等级的划分标准

(中国国家科学技术委员会，1993)

安全等级潜在危险程度

I对人类健康和生态环境尚不存在危险

II对人类健康和生态环境具有低度危险

III对人类健康和生态环境具有中度危险

IV对人类健康和生态环境具有高度危险六基因工程的生物安全性

8.生物安全性分级划分程序

安全性评价的程序和结果

程序目的结果

第一步确定受体生物的安全等级安全等级I、II、III或IV级第二步确定基因操作对安全性的影响类型安全类型I、II或III级第三步确定遗传工程体的安全等级安全等级I、II、III或IV级第四步确定遗传工程产品的安全等级安全等级I、II、III或IV级第五步确定接受环境对安全性的影响第六步确定监控措施的有效性第七步提出综合评价的结论和建议六基因工程的生物安全性

安全等级受体生物符合的条件

I对人类健康和生态环境未曾发生过不利影响；或演化成有害生物的

可能性极小；或仅用于特殊研究，存活期短，实验结束后在自然

环境中存活的可能性极小等。

II可能对人类健康和生态环境产生低度危险，但通过采取安全控制措施

完全可以避免其危害。

III可能对人类健康和生态环境产生中度危险，但通过采取安全控制措施

仍基本上可以避免其危害。

IV可能对人类健康和生态环境产生高度危险，而且尚无适当的安全控制

措施来避免其在封闭设施之外发生危害。如，可能与其他生物发生

高频率遗传物质交换的、或者尚无有效技术防止其本身或其产物逃逸、

扩散的有害生物；有害生物逃逸后，尚无有效技术保证在其对人类

健康或生态环境产生不利影响之前将其捕获或消灭等

9.

受体生物的安全等级及划分标准六基因工程的生物安全性10.基因操作对宿主生物的安全类型及划分标准

安全类型划分标准

l增加受体生物的安全性。如，去除致病性、可育性、适应性基因或抑制这些基因的表达等。2对受体生物的安全性没有影响。如，提高营养价值的贮藏蛋白基因，不带有危险性的标记基因等的操作.3降低受体生物的安全性。如，导入产生有害毒素的基因，引起受体生物的遗传性发生改变，会对人类健康或生态环境产生额外的不利影响；或对基因操作的后果缺乏足够了解，不能肯定所形成的遗传工程体其危险性是否比受体生物大。六基因工程的生物安全性受体生物基因操作的安全类型

安全等级123

III

I，II，III，IV

III，IIIIII，III，IV

IIII，II，IIIIIIIII，IV

IVI

，II,

III

，IVlVIV11.遗传工程体的安全等级与受体生物安全级和基因操作安全类型的关系六基因工程的生物安全性12.遗传工程体产品的安全等级基因工程工作安全性综合评价与建议?六基因工程的生物安全性13．影响生物安全性评价的因素

熟悉程度和分析能力的影响预期用途和潜在接受环境影响

安全控制措施的影响风险评价利弊平衡的影响六基因工程的生物安全性14．生物安全控制措施(按性质分)：类别方法含义举例

物理控制措施系指利用物理方法限制基因工程体如设置栅栏、网罩、屏障等。

及其产物在控制区外的存活和扩散。

化学控制措施系指利用化学方法限制基因工程体对生物材料、工具和有关设施

及其产物在控制区外的存活和扩散。进行化学药品消毒处理等。

生物控制措施系指利用生物措施限制基因工程体设置有效的隔离区及监控区，消除

及其产物在控制区外的生存、扩散试验区或控制区附近可与基因工

或残留，并限制向其他生物转移。程体杂交的物种以阻止基因工程体

开花授粉或去除其繁殖器官。

环境控制措施系指利用环境条件限制基因工程体如控制温度、水分、光周期等。

及其产物在控制区外的繁殖。

规模控制措施系指尽可能地减少用于实验的基因如控制其试验的个体数量或减少

工程体及其产物的数量或减少实验试验面积、空间等。

区的面积以降低基因工程体及其产

品迅速广泛扩散的可能性六基因工程的生物安全性

类别措施要求

实验室控制措施

相应安全等级的实验室装备；相应安全等级的操作要求（P1－P4级）

生物防护，分EK1－EK3级

中间试验和环境释放控制措施相应安全等级的安全控制措施。

商品贮运、销售及使用相应安全等级的包装、运载工具、

贮存条件、销售、使用具备符合

公众要求的标签说明。

应急措施针对基因工程体及其产物的意外

扩散、逃逸、转移，应采取的紧急措

施，含报告制度、扑灭、销毁设施等。

废弃物处理相应安全等级，采取防污处置的操作要求。

其他长期或定期的监测记录及报告制度。15．生物安全控制措施(按工作阶段分)：六基因工程的生物安全性16．基因工程产业化安全性：受体系统的潜在危险:

原核系统的生物安全性；

真核系统的生物安全性；重组活疫苗质粒DNA疫苗基因治疗的安全性医药生物技术产品潜在危险预防措施六基因工程的生物安全性第一章概论一基因工程与生物工程的关系二基因工程的基本定义三基因工程的基本形式四生物（工程）技术的其他内容五基因工程的发展史六基因工程的生物安全性七基因工程的意义P1-P4(Physicalprotection)BSL1-4(Biosafetylevel)实验室的生物安全水平分级根据所处理的微生物的危害程度,生物安全实验室分为四级：

生物安全一级实验室(BSL-1实验室)

生物安全二级实验室(BSL-2实验室)

生物安全三级实验室(BSL-3实验室)

生物安全四级实验室(BSL-4实验室)实验动物生物安全实验室：

其适用微生物范围与同级的一般生物安全实验室相同，差别在于适用于实验脊椎动物的饲养和动物模型实验。根据所处理的微生物的危害程度分为四级，分别称为ABSL-1，2，3，4实验室。为探索生命的奥秘提供了有用手段，为生物新技术应用创造条件：基因芯片、蛋白芯片。阐明了基因是遗传信息的载体。发现了多种基因新类型和全面的认识基因本质。从本质上阐明真核基因的表达调控分子机理，基因表达的时空特异性，核－质基因的协同表达，信号传递途径等。从整体水平研究高等生物的发育与分化过程多种生物的基因组序列分析，特别是《人类基因组计划》，

《水稻基因组计划》的实施与完成。开辟了“反向生物学的研究新途径。七基因工程的意义1.对生物科学研究的贡献：反向生物学reversebiology

定义：利用基因工程技术先分离出基因，经克隆后测序并进行表达，然后再研究其功能的学科。传统生物技术是根据生物的性状，找到有关的蛋白质，再确定其基因;现在可以先分离特定蛋白推测其基因或直接分离其基因，经克隆测序、表达，再研究其功能。这一过程与传统生物学相反，故称反向生物学。

概括地讲，其意义体现在以下三个方面：

●分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源●设计、构建生物的新性状甚至新物种：基因工程可以绕过远缘有性杂交的困难，使基因在微生物、植物、动物之间交流，迅速并定向的获得人类需要的新的生物类型。●大规模生产生物活性物质2.对实践的贡献：七基因工程的意义大规模生产生物活性物质工程细胞基因工程蛋白质工程途径工程发酵工程细胞工程分离工程酶酶工程分离工程野生细胞野生细胞生物活性物质3、基因工程与医药卫生我国生产的部分基因

工程疫苗和药物

许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。

微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。七基因工程的意义

胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。

将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！使其价格降低了30%-50%!3、基因工程与医药卫生

从人血中提取干扰素，300L血才提取1mg！

通过基因工程的方式创造了能合成人干扰素的大肠杆菌，每1Kg的培养液可提取20—40mg干扰素人造血液及其生产3、基因工程与医药卫生1977年，Genetech在美国旧金山市诞生1982年,人胰岛素获准上市，标志基因工程产品商品化进入实用阶段各种基因工程产品有：抗病毒剂，抗癌因子，新型抗生素，重组疫苗，免疫辅助剂，心血管防护急救药，抗衰老药，生长因子，基因治疗，诊断Kit等。3、基因工程与医药卫生七基因工程的意义生物技术主体产品①单克隆抗体（细胞杂交瘤技术）和重组蛋白药物：美国约1300家生物技术公司,60％以上事生物药品开发；欧洲约700家生物技术公司,43％以上从事生物药品开发.②疾病类型：治疗癌症，心脑血管，艾滋病，遗传疾病等药物。③主要上市药：胰岛素（第一个上市）人生长激素，红细胞生成素，干扰素，白细胞介素，集落刺激因子，疫苗，单抗等50多种获准上市。3、基因工程与医药卫生七基因工程的意义主要基因工程产品的研制、开发、上市时间产品时间国家用途上市时间国家人生长激素释放抑制素(SRM)1977日本巨人症人胰岛素1978美国糖尿病1982欧洲人生长激素（HGH）1979美国侏儒症1985美国人α-干扰素（IFN）1980美国病毒1985欧洲乙肝疫苗（HBsAgV）1983美国乙肝1986欧洲人白细胞介素1984美国肿瘤1989欧洲人促红细胞生成素（EPO）日本贫血1988欧洲人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美国人组织纤溶酶原激活剂（t-PA）血栓症1987美国3、基因工程与医药卫生七基因工程的意义1998年止美国有53种获FDA获准上市，使上千万人受益，生物技术产品的销售额增长迅速。

临床试验：350种正研究开发：2200种1980年美国现代生物技术产品销售额0增长1991年59亿美元基因工程药物1996年101亿美元80亿美元年增长13％1997年130亿美元2000年500亿美元200