色氨酸与TCBQ荧光性质的测定2

L-色氨酸与四氯苯醌（TCBQ）荷移荧光光谱法的研究摘要本文使用荧光光谱法研究了L-色氨酸与四氯苯醌（TCBQ）的荷移反应。通过实验可得知，L-色氨酸与TCBQ在水中，以pH=10.9溶液，活性剂为代十六烷基毗啶溶液，在20°C的室温下加热10min以后，可生成稳定的荷移络合物。此荷移络合物的最大激发波长入=284，最大发射波长入max=364，△F=0.32857+25.48571c（卩g/mL）（R=0.99902）,浓度在0~2.0ng/mL的范围内符合比尔定max律，回收率在98.59〜103.4%之内，相对标准偏差在0.96%以内，该方法最低检测限为0.037卩g/mL。关键词荧光猝灭法L-色氨酸四氯苯醌（TCBQ） 荷移反应1引言L-色氨酸（L-trytophan）是人类和动物必需的八种氨基酸之一，化学名称为 L-氨基吲哚基丙酸，别名L-胰化蛋白氨基酸、L-B-（3-吲哚基）-a-丙氨酸，它是含有吲哚基的芳香族氨基酸，呈白色或略带黄色的叶片状结晶或粉末，无臭有甜味，溶于热吡啶，微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚，在稀酸或稀碱中溶解。L-色氨酸有促进机体生长发育，修补组织细胞的作用；有为肌体提供营养的作用；对肌体内各种酶、激素的分泌起调节的作用；提高肌体的免疫抵抗能力的作用；运输其它营养物质和解毒的作用。L-色氨酸系氨基酸类药物，对抑郁症、失眠症、高血压、及止痛等有良效，在欧美一些国家已广泛应用于临床［1］。目前定量测定L-色氨酸的方法主要有高效液相色谱法［2-4］、电位滴定法［5］、原子吸收光谱法［6］、荧光光谱法［7,8］、分光光度法［9-11］、毛细管电泳分析法［12］、阻抑速差催化光度法［13］、线扫伏安法［14］、化学发光法［15-17］等。利用与四氯苯醌（TCBQ）发生荷移反应测定L-色氨酸含量的方法还未见报道。本文选用TCBQ为电子接受体，研究了L-色氨酸与TCBQ形成荷移络合物的条件，探讨了反应机理，并对药物样品进行了含量测定，结果令人满意。2实验部分主要仪器与试剂仪器LS55发光分光光度计（美国PE公司）；WGY-10型荧光分光光度计（天津市港东科技发展有限公司）；HH-6电热恒温水浴锅（北京科伟永鑫实验仪器厂）；92M-202A-DR电子天平（普利赛斯国际贸易〈上海〉有限公司）；211型酸度计（意大利Hanna）,XYJ-802离心沉淀机（江苏医疗仪器厂）。试剂L-色氨酸（天津市大茂化学仪器供应站），TCBQ（sigma-Aldrich），溴代十六烷基吡啶（天津市光复精细化工研究所）。所用试剂中溴代十六烷基吡啶为化学纯，其余均为分析纯，实验用水为超纯水。溶液的配制方法L-色氨酸溶液的配制：准确称取0.25000gL-色氨酸，用水溶解，转移到250mL的容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，配成lg/L的溶液。准确量取1mllg/L的L-色氨酸，用水溶解，转移到lOOmL的容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，配成0.01g/L的溶液。pH=10.9的三酸缓冲溶液：分别取2.70mL磷酸、2.29mL冰醋酸、2.47g硼酸于1000mL容量瓶中并稀释至刻度，在酸度计下，用0.2mol/L的氢氧化钠调节至pH=10.9。TCBQ溶液的配制：准确称取0.25000gTCBQ，用少量的乙醇溶解，转移到250mL的容量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀，配成1g/L的溶液。硼砂溶液的配制：准确称取38.14g四硼酸钠，用水溶解，转移到1000mL的容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，配成0.1mol/L的溶液。溴代十六烷基吡啶溶液的配制：准确量取5mL的溴代十六烷基吡啶于烧杯中，用500mL水溶解，配成0.1mol/L的溶液，摇匀后，置于试剂瓶中备用。样品的制备：血清1.0mL于10mL离心试管中，加3.0mL乙醇除蛋白,静置5min4000r/min离心10min,取上清夜于比色管中。实验方法准确移取适量O.Olg/L的L-色氨酸溶液分别于两支10mL比色管中，其中一支依次加入表面活性剂溴代十六烷基吡啶溶液0.7mL，用pH=10.9的三酸缓冲溶液稀释至刻度，另一支依次加入TCBQ乙醇溶液0.3mL、表面活性剂溴代十六烷基吡啶溶液0.7mL，并用pH=10.9的三酸缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，在室温下反应10min后，在负高压140，出射狭缝4nm，扫描间隔2min的条件下，用1cm石英比色皿，在284nm激发波长处，测定364nm处的发射荧光强度F〔和F『并计算荧光猝灭量△F二F－F。123结果与讨论实验条件的选择吸收光谱按照实验方法，用荧光分光光度计对水，TCBQ的乙醇溶液，色氨酸溶液，色氨酸-TCBQ溶液进行激发和发射光谱扫描，负高压为140，光谱通带均为4nm。在220nm〜800nm之间扫描。结果（图1、2）表明，水中TCBQ的激发值和荧光值都很低，对测定无干扰，色氨酸溶液的激发峰和发射峰分别为284nm和364nm；加入TCBQ，峰高明显下降，而峰形和峰位都没有发生显著的变化。实验选择的激发波长为284nm，发射波长为364nm。

30.0o60荧光强度图1不同浓度下的发射光谱谱图注释：从上至下谱线1~10分别如下：1-色氨酸（2.0mL）,2-色氨酸30.0o60荧光强度图1不同浓度下的发射光谱谱图注释：从上至下谱线1~10分别如下：1-色氨酸（2.0mL）,2-色氨酸（l.OmL）,3-色氨酸（2.0mL）--TCBQ,5-色氨酸（0.5mL）,6-色氨酸（0.2mL）,7-色氨酸（0.5mL）8-色氨酸（0.2mL）-TCBQ,9-色氨酸（O.lmL）,10-色氨酸TCBQ,4-色氨酸（l.OmL）-TCBQ,（O.lmL）-TCBQ荧光强度100.o軸80.0-uo6卜卜图2不同浓度下的激发光谱谱图注释：从上至下谱线1~10分别如下：1-色氨酸（2.0mL）,2-色氨酸（l.OmL）,3-色氨酸（2.0mL）--TCBQ,TCBQ,4-色氨酸（l.OmL）-TCBQ,5-色氨酸（0.5mL）,6-色氨酸TCBQ,4-色氨酸（l.OmL）-TCBQ,8-色氨酸（0.2mL）-TCBQ,9-色氨酸（O.lmL）,10-色氨酸（O.lmL）-TCBQ溶剂的影响选用不同的溶剂按实验方法配制溶液，测定相应络合物的激发强度和发射强度并计算其猝灭量，结果（表1）表明，在乙醚、乙醇、乙腈、丙酮、二甲亚砜中试剂均有沉淀或分层现象，结果（表2）表明，溶剂用水和甲醇所得的结果差不多，但因考虑到甲醇有毒成本较贵，则本实验采用水为溶剂。表1溶剂的影响溶剂乙醚乙醇乙腈 甲醇水丙酮二甲亚飒现象分层淡粉沉乳黄沉溶液溶液白色沉乳黄沉淀淀淀淀表2溶剂的影响溶剂L-色氨酸发射L-色氨酸与TCBQ发射△F甲醇44.925.719.2水33.118.914.22—L-色氨酸的荧光强度；4一L-色氨酸与2—L-色氨酸的荧光强度；4一L-色氨酸与TCBQ荧光强度;明，从表3、4、5中可看出，选取在室温，反应时间10min的条件下，发射的强度大且猝灭量较大且稳定。表3温度（19.8°C）和时间的影响时 间(min)1(nm)23(nm)4△F0358.033.2360.023.79.55360.033.3358.023.69.710358.033.1358.023.29.915358.032.8358.023.09.820358.032.7358.023.09.725358.032.3360.022.69.730358.031.9360.022.49.535358.032.1358.022.29.940358.032.5358.021.610.945360.032.2358.021.810.450360.032.8358/021.611.255358.032.9360.021.711.260360.033.0360.021.711.370358.033.2360.021.511.780358.033.5358.021.512.090358.032.9358.021.111.8100358.032.2358.021.111.1注释：1一L-色氨酸的发射峰位；3—L-色氨酸与TCBQ发射峰位;

表4温度（30°C）和时间的影响时 间(min)1(nm)23(nm)4△F0358.029.9358.025.44.55360.027.4358.022.05.410360.025.8360.020.35.515358.025.8360.019.86.020360.026.0360.019.36.725358.026.3360.018.77.630360.025.8360.019.06.835360.025.9360.018.17.840360.025.6360.018.07.645360.025.8360.017.78.150358.025.2358.017.67.655358.025.7360.017.68.160358.025.9358.017.48.570360.025.8358.017.58.380358.025.6360.016.88.890358.025.6360.016.09.6100360.025.1360.016.28.9注释：1—L-色氨酸的发射峰位； 2—L-色氨酸的荧光强度；3—L-色氨酸与TCBQ发射峰位； 4—L-色氨酸与TCBQ荧光强度；表5温度（40C）和时间的影响时 间(min)1(nm)23(nm)4△F0360.033.1358.024.8&35360.026.3360.021.05.310360.024.4360.019.45.015358.024.0360.019.14.920358.024.8360.019.35.525360.025.1360.019.55.630358.025.3360.018.86.535360.024.6358.018.75.940358.024.8360.019.15.745358.024.8360.018.66.250358.024.6360.018.56.155360.025.0360.018.16.960358.024.7360.018.16.670360.025.3360.017.57.880362.024.4360.017.27.290358.024.2362.017.07.2注释：1—L-色氨酸的发射峰位； 2—L-色氨酸的发射强度；3—L-色氨酸与TCBQ发射峰位； 4—L-色氨酸与TCBQ发射强度；表面活性剂的影响按照实验方法配制溶液，分别加入不同的表面活性剂，浓度均为O.1mol/L，用量均为1mL，测定L-色氨酸的发射强度及其猝灭量，结果（表6）表明，十二烷基硫酸钠、曲拉通X-100、溴代十六烷基吡啶猝灭量较大，但由于（表7）表明，曲拉通X-100本身就有强的荧光，而溴代十六烷基吡啶的猝灭量相对于十二烷基硫酸钠较大，所以本实验采用溴代十六烷基吡啶溶液作为表面活性试剂。表6表面活性剂的影响表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵十二烷基磺酸钠不加表面活性剂十二烷基硫酸钠溴代十六烷基吡啶曲拉通X-100叶温20叶温801(nm)366.0364.0364.0312.0364.0>100366.0364.0244.144.944.167.835.5—41.243.83(nm)364.0364.0364.0360.0370.0>100366.0364.0425.931.928639.49.0—32.928.9△F18.213.015.528.426.5—8.314.9注释：1一L-色氨酸的发射峰位； 2—L-色氨酸的发射强度；3—L-色氨酸与TCBQ发射峰位； 4—L-色氨酸与TCBQ发射强度;表7表面活性剂的影响表面活性剂十二烷基硫酸钠曲拉通X-100曲拉通X-100本身溴代十六烷基吡啶1(nm)358.0306.0308.0364.0262.082.272.338.53(nm)358.0308.0304.0366.0444.232.682.29.3△F17.849.6—29.2注释：1一L-色氨酸的发射峰位； 2—L-色氨酸的发射强度；3—L-色氨酸与TCBQ发射峰位； 4—L-色氨酸与TCBQ发射强度；表面活性剂用量的影响按实验方法改变溴代十六烷基吡啶溶液的用量，结果（表8）表明。溴代十六烷基吡啶溶液的用量为0.7mL时，猝灭量较大，本实验采用用量为0.7mL。表8表面活性剂用量的影响量}用<00.50.70.91.01.11.31.52.01(nm)364.0360.0362.0362.0360.0364.0364.0364.0357.0244.740.036.833.933.130.428.526.024.13(nm)360.0368.0362.0364.0362.0366.0366.0366.0359.0436.514.810.98.69.512.811.810.611.0△F&225.225.925.323.617.616.715.413.1注释：1—L-色氨酸的发射峰位； 2—L-色氨酸的发射强度；3—L-色氨酸与TCBQ发射峰位； 4—L-色氨酸与TCBQ发射强度；3.1.6试剂TCBQ用量的影响按照实验方法改变试剂TCBQ溶液的用量，结果（表9）表明，TCBQ的用量为0.30mL时，猝灭量最大。但当TCBQ用量大于0.40ml时，试剂完全猝灭，没有定量关系，所以本实验采用TCBQ用量为0.30ml表9试剂TCBQ用量的影响用量(nm)00.010.020.060.10.150.200.30△F—2.65.616.819.124.529.330.83.1.7酸度的影响分别以0.1mol/L硼砂溶液和pH值不同的三酸溶液为缓冲溶液，按照实验方法测定其发射强度并计算其猝灭量，结果见表10、11、12、。由表10可知，在pH=10—11L-色氨酸的发射强度最大并且猝灭量最大；表11表明，在pH=10.5—11.5L-色氨酸的发射强度最大并且猝灭量最大；表12表明，在pH=10.9猝灭量最大，则本实验选用pH=10.9为缓冲溶液。表10酸度的影响PH1（nm）23(nm)4△F硼砂358.034.4360.022.212.20354.015.9356.03.412.51354.09.9356.06.93.0

2356.012.3357.08.63.73357.018.0357.013.14.94357.021.7353.013.08.75351.020.8349.015.45.46345.019.9343.013.56.47339.019.4335.013.75.78331.021.9330.014.37.69334.025.9332.018.47.510334.043.1332.028.015.111332.054.3332.032.721.612332.08.0334.04.73.313326.07.9326.03.94.014无蜂————注释：1—L-色氨酸的发射峰位；3—L-色氨酸与TCBQ发射峰位；表112—L-色氨酸的发射强度；4—L-色氨酸与TCBQ发射强度；酸度的影响pH1(nm)23(nm)4△F10.0360.041.9360.031.310.610.5360.047.1360.035.511.611.0360.050.8360.036.814.011.5360.033.1362.022.710.412.0360.07.2362.03.24.0注释：1一L-色氨酸的发射峰位；3—L-色氨酸与TCBQ发射峰位；2—L-色氨酸的发射强度；4—L-色氨酸与TCBQ发射强度；表12酸度的影响PH1(nm)23(nm)4△F10.5364.043.1278.031.711.410.7364.045.9278.031.114.810.9364.044.1278.028.615.511.0364.045.2278.031.614.611.1364.043.8278.029.913.811.3364.039.9280.029.110.8注释：1—L-色氨酸的发射峰位； 2—L-色氨酸的发射强度；3—L-色氨酸与TCBQ发射峰位； 4—L-色氨酸与TCBQ发射强度；3.1.8加入次序的影响按照实验方法配制溶液，改变L-色氨酸、TCBQ、缓冲溶液及溴代十六烷基吡啶溶液的加入次序,测定其猝灭量，结果（表13）表明，加入次序为L-色氨酸、TCBQ、溴代十六烷基吡啶缓冲溶液时,测得的猝灭量最大。

表13加入次序的影响序号12 3 456△F14.315.1 15.8 14.414.914.1各序号加入次序分别为：1，L-色氨酸、TCBQ、溴代十六烷基吡啶、PH缓冲溶液2,L-色氨酸、溴代十六烷基吡啶、TCBQ、PH缓冲溶液3,TCBQ、L-色氨酸、溴代十六烷基吡啶、PH缓冲溶液4,TCBQ、溴代十六烷基吡啶、L-色氨酸、PH缓冲溶液5,溴代十六烷基吡啶、L-色氨酸、TCBQ、PH缓冲溶液6,溴代十六烷基吡啶、TCBQ、L-色氨酸、PH缓冲溶液精密度的测定在选定的最佳条件下，移取相同量的L-色氨酸溶液，按实验方法平行测定10次，结果（见表14）。计算得，相对标准偏差为0.96%。表14精密度的测定编号12345678910△F44.244.443.843.644.844.543.544.144.344.03.3工作曲线的绘制按实验方法，准确移取不同量的L-色氨酸溶液，在选定的最佳条件下，分别测色氨酸本身和色氨酸-TCBQ体系的荧光值，求两者荧光猝灭量，并绘制工作曲线（数据见表15,见图3），结果表明，该方法下得L-色氨酸含量0~2.0“g/mL时荧光猝灭量与色氨酸的含量呈良好的线性关系，线性回归方程AF=25.48571C+0.32857（单位为Ag/mL）,相关系数R=0.99902，该方法下最低检测限为C=0.037Ag/mL（以3S/K计算，S为试剂空白测定值的标准偏差，S=0.425，K为工作曲线的斜率）。即在该方法中，当其信噪比为3时，该方法最低检测限为0.037Ag/mL。表15工作曲线的测定加入体积（mL）0.01.01.52.02.53.0浓度C（Ag/mL）0.01.01.52.02,53.0F10.028.243.656.667.577.7F20.02.43.76.37.810.0△F0.025.839.950.359.767.73.4反应机理的探讨按实验方法，分别在20°C和30°C下，准确移取不同量的L-色氨酸溶液，反应后测定络合物的猝灭量，并绘制曲线（数据见表16,见图4），结果表明，色氨酸与四氯苯醌反应属于静态猝灭。表16反应机理的测定用量（mL）11.52.02.53.0△F(20C)23.835.846.354.964.4△F(30C)029.540.148.455.0图4反应机理的探讨注释：1—上面线是20C下；2—下面线为30C下荧光猝灭就是激发态的荧光分子通过各种外转换过程失去能量使荧光强度降低的现象。如果荧光物质以外的其它物质存在时使其荧光猝灭，则该物质称为猝灭剂，在本实验中TCBQ就是色氨酸的一种猝灭剂。基态荧光分子与猝灭剂之间通过弱的结合生成复合物，使荧光猝灭的现象成为静态猝灭；激发态荧光分子与猝灭剂碰撞使其荧光猝灭的现象称为动态猝灭。一般来说，待测物质溶液温度升高，荧光强度降低，这是因为温度升高后，待测物质分子运动速率加快，有效碰撞增加，将消耗部分能量，从而降低荧光效率。由30C和室温下的数据可以看出室温下色氨酸的猝灭程度比30C色氨酸的猝灭程度大。因此，TCBQ使色氨酸的荧光猝灭是一种静态猝灭，即DBQ与色氨酸发生反应，导致色氨酸的荧光强度降低。因为30C和室温相比较，待测物质溶液温度高，分子运动速率加快，有效碰撞增加，荧光强度的猝灭程度应该比室温下的荧光强度的猝灭程度大，但这与实验数据相反，所以该猝灭分析法是一种静态猝灭分析法。4样品测定及回收率实验4.1样品的测定取血清1.0mL于10mL的离心试管中，加入3.0mL的乙醇除蛋白，静置5min，放入XYJ-802离心沉淀机中，4000r/min，离心10min。取上清液0.2mL于10mL的比色管中，用pH为10.90的三酸缓冲溶液稀释到刻度，摇匀；取上清液0.2mL于10mL的比色管中，加入1.0mLTCBQ乙醇溶液，用pH为10.90的三酸缓冲溶液稀释到刻度，摇匀，充分混合作用10min。测得血清，血清TCBQ体系的荧光强度均为0。

4.2回收率实验按照样品测定方法在0.2mL的血清中，分别加入不同量的0.01g/mL的色氨酸的标准溶液，用标准加入法测定，其结果见表17,表18。由表18可知，血清的回收率为98.8〜103.2%。表17标准加入法测样品数据加入体积(mL)1.52.02.5色氨酸-血清41.154.066.7荧光色氨酸-血清1.32.23.4强度TCBQ荧光猝灭量△F39.851.863.3表18回收率实验数据样品色氨酸加入量/临测得总量(n=3)回收率(%)血清11.51.549103.2血清22.02.202101.0血清32.52.47198.85干扰实验的测定本实验采用浓度0.5g/L的NaCl、KCl、苯丙氨酸、酪氨酸、硝酸镍、硝酸钙、葡萄糖、蔗糖作为干扰物质，检测对实验有无干扰，结果如表19所示：NaCl、KCl、苯丙氨酸、葡萄糖、蔗糖的量是色氨酸量的50倍以下时均无干扰，而酪氨酸、硝酸钙的量是色氨酸量的30倍以下时无干扰，而硝酸镍是色氨酸量的0.5倍时无干扰，实验证明：硝酸镍对实验干扰最大。表19回收率的测定干扰物不加1mLNaCl1mLKCl1mL苯0.6mL丙氨酪氨0.01mL硝酸镍0.6mL硝酸钙1mL葡萄糖1mL蔗糖酸酸猝灭量41.542.739.040.736.57.33540.138.9干扰量00.29%6.02%1.93%7.99%2.05%0.91%3.37%6.26%参考文献宋文霞，王瑞明.L-色氨酸的研究[J].农产品加工学刊，2005，(3)：18—20.李家胜，陈忠明.高效液相色谱法测定饲料中色氨酸含量[J].饲料工业，1999，(5)：219—222.陈永波，饶斌，覃兰.高效液相色谱法快速直接测定酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸[J].氨基酸和生物资源，2000，22(1)：55—58.陈扬，于燕梅，骆广生.高效液相色谱分析法测定色氨酸对映体[J].分析测试技术与仪器，200612(4)：213—217.范哲锋，杜黎明，靳晓涛.色氨酸荧光猝灭法测定人发稀土总量[J].分析化学，2001，29(9)：1049—1051.胡宝祥，杨未，刘文函，王晓兵•原子吸收光谱间接测定色氨酸的研究[J].光谱实验室，2006,23(6)：1307—1310.魏永锋，马冬梅，赵琼.比值导数荧光光谱法同时测定色氨酸和5-羟基色氨酸[J].分析试验室,2006，25(9)；75—77.何云华，赵小瑾.流动注射化学发光法测定L-氨基酸[J].汉中师范学院学报，2000,18(2)：49－52．任娇艳，赵谋明，王金水，崔春•分光光度法测定蛋白酶解物中的色氨酸[J].食品科学，2006,27(12)：591—593.许前会，王慧彦，李艳辉，程青芳•对二甲氨基苯甲醛分光光度法测定色氨酸[J].甘肃科技，2006，22(12)：50~51.孙昕•分光光度法测定立类及其粗蛋白质中的色氨酸[J].生物学杂志，2000，17(5)：33—34.杨晓云，徐汉虹•色氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的高效毛细管电泳分析[J].分析测试学报，2001,20(3)：16—18.孙衍华，杨景芝.阻抑速差催化光度法测定痕量色氨酸和酪氨酸[J].分析化学，2004，32(8)：89—91.王晓莹，魏永锋，马冬梅，赵琼•线扫伏安法同时测定5-羟基色氨酸和色氨酸[J].化学通报，2007(6)：459—462.[15]AlwarthanAA.Chemiluminescentdeterminationoftryptophaninaflowinjectionsystem[J].Anal.Chim.Acta，1995，317，233—237.ChenGN，XuXQ，DuanJP，