枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件的优化

枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件的优化LIUWenlong;WANGXingji;WANGKefen;WANGShuai【摘要】选用玉米粉、豆饼粉、KH2PO4及Na2HPO4为基础配方，通过单因素实验对枯草芽孢杆菌发酵产中性蛋白酶的培养基组分及培养条件进行优化.确定了优化的发酵培养基为：20g-L-1甘油,30g-L-1豆饼粉,2mmol-L-1氯化钙,0.3g-L-1KH2PO4,4g-L-1Na2HPO4;优化的发酵条件为:温度30°C,接种量5%.调控发酵培养基pH值7.0控制发酵，发酵周期40h,最终的酶活达到7344U-mL-1.进行甘油补料流加实验，培养温度30C,发酵过程控制pH值7.0,调整转速和风量控制溶氧30%~35%,接入5%种子，经过40h发酵,最终酶活达到10654U-mL-1,较未补料提高了45%.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷)，期】2019(036)001【总页数】6页(P47-52)【关键词】枯草芽孢杆菌;中性蛋白酶;液体发酵;酶活性【作者】LIUWenlong;WANGXingji;WANGKefen;WANGShuai【作者单位】;;;【正文语种】中文蛋白酶是一类在生理及商业上都有非常重要地位的水解酶类，能催化肽键水解成氨基酸或短肽，其销售量约占酶制剂市场的一半以上［1］。按蛋白酶作用的最适pH值可分为酸性、中性和碱性蛋白酶。中性蛋白酶是最早被应用的蛋白酶之一，能在中性pH值范围内将大分子蛋白质水解成相对分子量在5000以下的多肽［2］，普遍存在于细菌和真菌中，在pH值7~8时活性最大［3］。目前，中性蛋白酶高产菌株主要通过自然界筛选、人工诱变和分子生物学改造获得［4-8］。近年来，国外研究侧重于基因结构特性研究、定点突变改变蛋白酶的特性、稳定性的提高、与医学相关的蛋白酶的分离鉴定、蛋白酶的应用等［9-12］。市场销售的中性蛋白酶的主要生产菌种包括细菌类的枯草芽孢杆菌、耐热解蛋白芽孢杆菌，真菌类的寄生曲霉菌、灰色链霉菌、栖土曲霉菌、米曲霉菌等［13］,其中枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶是市场销售最广泛的中性蛋白酶。枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶具有发酵周期短、安全性好、酶活高等特点。枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的酶分子中的2~3个酪氨酸和1个组氨酸残基同锌原子一起表现酶的活性，同时1个色氨酸和几个钙原子在维持酶的构象上有重要作用。中性蛋白酶被广泛用于食品和烹饪行业［14］、丝绸、饲料工业［15］。工业化生产的中性蛋白酶主要由微生物经液体深层发酵和固体发酵制得，其中液体深层发酵因操作条件可控而应用较广泛。在液体发酵过程中蛋白酶直接由细胞产生分泌到培养液中，属于胞外酶。因发酵液中含有多种物质，为得到高酶活的中性蛋白酶及降低生产成本，不仅需要提高发酵水平，而且还要对发酵液进行提取分离［16］。产蛋白酶菌株的培养基主要成分包括碳源、氮源、金属离子等［17-18］。细菌产中性蛋白酶按其催化机制属于金属蛋白酶，因此无机盐的浓度对产酶会有很大影响［19］。结合目前行业的发展状况，作者采用枯草芽孢杆菌生产中性蛋白酶，对其发酵培养基、培养条件及发酵条件进行优化，旨在提高该菌株的发酵水平，降低生产成本，为后续试验及扩大化生产提供帮助。1实验1.1菌种与培养基枯草芽孢杆菌：实验室筛选保藏菌种。斜面培养基©L-1):牛肉膏5，胰蛋白腺10，氯化钠10，琼脂18,pH值7.5。种子培养基(g-L-1):酵母粉5，蛋白腺5，氯化钠10，pH值7.5。发酵培养基(g-L-1):玉米粉30，豆饼粉30,KH2PO40.3,Na2HPO44,pH值自然。固体平板培养基©L-1):脱脂奶粉14,酵母粉1.5，琼脂18。1.2培养方法将种子接于斜面上，30°C下培养48h；挑取斜面活化菌体到25mL种子培养基中，30C、220r-min-1培养10h,以3%的接种量转接到50mL/250mL的种子培养基中，30C下发酵培养；以5%的接种量接到含18L发酵培养基的30L发酵罐中，30C下培养。1.3中性蛋白酶酶活的测定按照GB/T23527-2009[20]采用福林酚法测定。酶活力单位定义：1mL液体酶在40C、pH值7.5的条件下，1min水解酪蛋白产生项g酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U-mL-1表示。1.4菌体生物量的测定取发酵液1mL，采用梯度稀释的方法，在固体平板上30C下培养，进行3组平行实验，菌落计数。2结果与讨论2.1发酵培养基主要成分的优化培养基对微生物生长发育、物质代谢、发酵产物的积累都有很大的影响。另外，在发酵工业中，培养基需求量很大，配制培养基应尽量利用廉价易得的原料，以降低成本。本实验对枯草芽孢杆菌液态发酵产中性蛋白酶发酵培养基的主要成分及配比进行优化。2.1.1碳源对产酶的影响将发酵培养基中的玉米粉分别用葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、乳糖、甘油、马铃薯淀粉、红薯淀粉替换，其它成分不变，于30OC、220r-min-1培养，测定发酵液上清中性蛋白酶酶活，结果如图1所示。图1碳源对中性蛋白酶酶活的影响Fig.1Effectofsolecarbonsourceonneutralproteaseactivity由图1可知，碳源对酶活的影响较大，其中以甘油为碳源时，酶活最高，为3214U-mL-1，其次为玉米粉、蔗糖、马铃薯淀粉、乳糖、葡萄糖、红薯淀粉、玉米淀粉。以葡萄糖为碳源时，酶活较低，因为葡萄糖作为快速利用碳源，在培养基中含量过多会对产酶有抑制作用。以甘油、蔗糖为碳源时，酶活相对较高，表明微生物利用这两种碳源较好，反馈抑制较小。玉米粉也可促进菌体产酶，原因是玉米粉含有多种微生物需要的营养成分，能促进中性蛋白酶的生成。因此，选择甘油为优化发酵培养基的碳源。2.1.2甘油浓度对产酶的影响以甘油为发酵培养基的碳源，将甘油浓度按梯度设为10g・L-1、20g・L-1、30g・L-1、40g・L-1、50g・L-1,其它成分不变，进行发酵实验，测定发酵液上清中性蛋白酶酶活，以相对酶活来表示酶活大小，最大酶活设为100%，结果如图2所示。图2甘油浓度对中性蛋白酶酶活的影响Fig.2Effectofglycerinconcentrationonneutralproteaseactivity由图2可知，甘油浓度为20g-L-1时，酶活达到最高，较浓度为30g-L-1高了5%，甘油浓度过低或过高都会对产酶有很大影响。微生物代谢需要足够的碳源，其浓度较低导致微生物利用不充分，影响生长代谢，进而影响产酶；浓度过高则提高了微生物外部环境的渗透压，细胞脱水，导致细胞受损或死亡，形成代谢阻遏，抑制产酶。因此，选择优化发酵培养基的碳源甘油浓度为20g-L-1o2.1.3氮源对产酶的影响将发酵培养基中的豆饼粉分别用硝酸钠、大豆蛋白腺、硫酸铵、蛋白腺、胰蛋白腺、酵母粉、玉米浆替换，其它成分保持不变，于30OC、220r-min-1培养，测定发酵液上清中性蛋白酶酶活，结果如图3所示。图3氮源对中性蛋白酶酶活的影响Fig.3Effectofsolenitrogensourceonneutralproteaseactivity由图3可知，无机氮源与有机氮源对酶活影响区别很大，无机氮源硝酸钠、硫酸铵对酶活影响较小，酶活处于较低水平；有机氮源对酶活影响较大，影响大小依次为：豆饼粉〉酵母粉〉大豆蛋白腺〉蛋白腺〉胰蛋白腺〉玉米浆。豆饼粉作为氮源时，酶活达到最高，为3127U-mL-1。因此，选择豆饼粉为优化发酵培养基的氮源。2.1.4豆饼粉浓度对产酶的影响选取豆饼粉为发酵培养基的氮源，将豆饼粉浓度按梯度设为10g・L-1、20g・L-1、30g・L-1、40g・L-1、50g・L-1,其它成分不变，进行发酵实验，测定发酵液上清中性蛋白酶酶活，以相对酶活来表示酶活大小，最大酶活设为100%，结果如图4所示。图4豆饼粉浓度对中性蛋白酶酶活的影响Fig.4Effectofsoybeancakepowderconcentrationonneutralproteaseactivity由图4可知，豆饼粉浓度为30g-L-1时，酶活最高，表明此浓度利于产酶。因此，选择优化发酵培养基的氮源豆饼粉浓度为30g-L-1o2.1.5无机盐对产酶的影响在优化发酵培养基碳源、氮源的基础上添加无机盐进行发酵实验，分别添加1mmol-L-1的硫酸锌、硫酸镁、硫酸锰、氯化钙、氯化钠、硫酸亚铁于优化发酵培养基中，测定发酵液上清中性蛋白酶酶活，结果如图5所示。图5无机盐对中性蛋白酶酶活的影响Fig.5Effectofinorganicsaltonneutralproteaseactivity由图5可知，对酶活影响最大的是氯化钙，其次是硫酸镁，其它无机盐(金属离子)对产酶都有不同程度的抑制作用。可能是因为，豆饼粉中已含有微生物生长代谢所需要的少量无机盐离子，盐离子过多会抑制菌体代谢。采用不同浓度的氯化钙及硫酸镁进行发酵实验，考察其对酶活的影响，用相对酶活表示不同浓度盐离子(Ca2+、Mg2+)对酶活的作用大小，对照为未添加这2种离子的发酵培养基，结果如图6所示。图6不同浓度Ca2+和Mg2+对中性蛋白酶酶活的影响Fig.6EffectofdifferentconcentrationsofCa2+andMg2+onneutralproteaseactivity由图6可知，2mmol-L-1的Ca2+和Mg2+对酶活的影响较大，均高于对照组，表明添加一定量的Ca2+或Mg2+对产酶有一定的促进作用，Ca2+的促进作用更显著些。因此，确定在优化发酵培养基中添加2mmol-L-1Ca2+o2.1.6磷酸盐对产酶的影响磷元素是菌体生长繁殖所需的重要元素，并且发酵培养基中的磷酸盐对pH值起到缓冲作用，避免pH值短时间内迅速改变。为考察优化发酵培养基中添加磷酸盐对产酶的影响，进行两组实验，一组含有0.3g-L-1KH2PO4、4g-L-1Na2HPO4,另一组不含磷酸盐，测定酶活及菌体生物量，结果如图7所示。由图7可知，菌体生物量与酶活的变化趋势基本相同，菌体生物量的增加影响酶活的升高。表明添加磷酸盐可以促进菌体的生长，有效提高酶活。因此，确定在优化发酵培养基中添加KH2PO4和Na2HPO4。2.2培养条件的优化2.2.1培养温度对产酶的影响培养温度在发酵过程中起着非常关键的作用，影响着微生物的整个代谢过程，分别设置培养温度为28°C、30°C、32°C、35°C、37°C进行发酵实验，测定发酵液上清中性蛋白酶酶活，结果如图8所示。图7磷酸盐对中性蛋白酶酶活的影响Fig.7Effectofphosphateonneutralproteaseactivity图8培养温度对中性蛋白酶酶活的影响Fig.8Effectofculturetemperatureonneutralproteaseactivity由图8可知，培养温度为30°C时，酶活最高；低于30°C时酶活较低，高于30C时酶活呈梯度下降。这是因为，当培养温度过低时，菌体代谢较慢，产酶量也较少；当培养温度过高时，菌体代谢所需酶的活性降低，导致发酵减缓，从而影响酶活。因此，选择培养温度为30C。2.2.2接种量对产酶的影响接种量也会影响菌体代谢。分别设定接种量为2%、3%、5%、7%、9%进行发酵实验，测定发酵上清中性蛋白酶酶活，结果如图9所示。图9接种量对中性蛋白酶酶活的影响Fig.9Effectofinoculumonneutralproteaseactivity由图9可知，接种量为5%时，酶活最高。接种量小，菌体生长缓慢，酶活较低；接种量较大，前期菌体生长迅速，营养物质迅速消耗，并产生大量代谢废物及有毒物质，抑制中后期菌体生长，导致酶活降低。因此，选择接种量为5%。2.3发酵条件的优化2.3.1发酵罐产酶pH值的优化采用30L发酵罐对优化后的发酵培养基进行验证实验，装液量18「转速300r-min-1,通气量为2vvm，固定罐压。pH值对菌体发酵培养及产酶有至关重要的影响，通过补加磷酸控制发酵培养基的pH值，根据菌体特性和产酶条件，分别设置pH值为7.0、7.5及pH值自然进行发酵实验，测定发酵液上清中性蛋白酶酶活，结果如图10所示。图10发酵培养基pH值对中性蛋白酶酶活的影响Fig.10EffectofpHvalueoffermentationmediumonneutralproteaseactivity由图10可知，发酵过程中控制pH值时，前24h中性蛋白酶酶活随着发酵时间的延长不断上升，而后呈下降趋势；控制pH值为7.0时，酶活在24h达到最高，为7344U-mL-1;pH值7.5的酶活变化趋势与pH值7.0相同。发酵过程中不控制pH值时，酶活持续处在较低水平，发酵21h酶活达到最高，而后酶活降低并趋于平稳。因此，在后续补料过程中控制pH值为7.0。2.3.2发酵罐补料产酶的优化碳源在菌体发酵过程中起着至关重要的作用，因此在发酵罐培养过程中不断流加碳源促进菌体生长。发酵过程控制pH值为7.0，在发酵15h时流加甘油进行补料实验，发酵过程通过调整转速和通风量控制溶氧30%~35%，测定发酵液上清中性蛋白酶酶活及菌体生物量，结果如图11所示。由图11可知，在10-27h菌体处于对数增长期，菌体生物量急速增加，酶活在此期间也快速升高；27h时菌体生物量达到最多，后缓慢减少；酶活在30h时达到最高，为10654U-mL-1，较未补加甘油提高了45%，表明流加甘油对菌体产酶有非常大的促进作用。图11补料对产酶的影响Fig.11Effectoffed-batchonproductionofneutralprotease2.4讨论本研究采用单因素实验优化发酵培养基，但是未能细化培养基的组成，也未研究表面活性剂等因素对酶活的影响，这样会对结果有一定影响；在补料过程中仅补加单—碳源，营养成分较单一，可能对产酶量的提高相对较低，后续可以考虑配合其它营养进行补料实验，提高产酶量。枯草芽孢杆菌在代谢过程中会分泌多种酶，产生酶系的种类与产酶量有很大的关系，因此在应用于生产的同时要明确酶之间的相互影响，确定最佳的发酵条件，保证质量。在此基础上可对产酶菌株进行诱变处理，进一步提高酶活。3结论以枯草芽孢杆菌为出发菌株，用低成本的农副产品及无机盐为主要原料进行了液体发酵产中性蛋白酶的优化实验。选用玉米粉、豆饼粉为发酵培养基的碳源、氮源，确定了枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的最优发酵培养基及培养条件，最优发酵培养基:20g-L-1甘油，30g-L-1豆饼粉，2mmol-L-1氯化钙，0.3g・L-1KH2PO4,4g・L-1Na2HPO4。通过调控发酵培养基的pH值控制发酵，结果表明，pH值为7.0时酶活更高，发酵24h酶活达到7344U・mL-1。进行流加甘油实验，培养温度30°C，控制pH值7.0，调整转速和通风量控制溶氧30%~35%，接种量5%,经过30h发酵，酶活达到10654U-mL-1，较未补料提高了45%。参考文献：【相关文献】RAVIKUMARG,GOMATHID,KALAISELVIM,etal.AproteasefromthemedicinalmushroomPleurotussajor-cajuproduction,purificationandpartialcharacterization[J].TropicalBiomedicine,2012,2(1):S411-S417.姜锡瑞，段刚，周红伟.酶制剂应用技术问答[M].北京：中国轻工业出版社，2008:45-70.由德林.酶工程原理[M].北京：科学出版社，2011:40-47.刘东旺.芽孢杆菌N19中性蛋白酶发酵条件及其酶学性质研究[D].保定：河北农业大学，2008.LIUDW.FermentationconditionsandcharacteristicsofneutralproteasefromBacillusN19[D].Baoding:HebeiAgriculturalUniversity,2008.赵丛，张敏，王建玲，等.N+离子注入诱变选育中性蛋白酶高产菌株及发酵条件的研究[J]工业微生物，2008,38(3):12-16.ZHAOC,ZHANGM,WANGJL,etal.BreedingofneutralproteaseproducingstrainandfermentationconditionsbyN+ionimplantationmutagenesis[J].IndustrialMicrobiology,2008，38(3):12-16.许波，黄遵锡，陈金全，等枯草芽孢杆菌AS1.398中性蛋白酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达[J].云南师范大学学报(自然科学版)，2005，25(3):51-56.XUB，HUANGZX,CHENJQ,etal.CloningofBacillussubtilisAS1.398neutralproteinasegeneanditshighexpressioninPichiapastoris[J].JournalofYunnanNormalUniversity(NaturalSciencesEdition),2005,25(3):51-56.WANGLF,RODNEYJD.ExpressionofBacillussubtilisneutralproteasegene(nprE)inSaccharomycescerevisiae[J].JournalofGeneralMicrobiology,1993(139):343-347.张敏，赵丛，路福平，等.中性蛋白酶基因在大肠杆菌中诱导表达条件的研究[J].食品与发酵工业，2007,33(10):31-34.ZHANGM,ZHAOC,LUFP,etal.ResearchonexpressionconditionofneutralproteaseintheE.coli[J].FoodandFermentationIndustries,2007,33(10):31-34.KATZME,MASOUMIA,BURROWSSR,etal.TheAspergillusnidulansxprFgeneencodesahexokinase-likeproteininvolvedintheregulationofextracellularproteases[J].Genetics,2000,156(4):1559-1571.MANSFELDJ,PETERMANNLE,DURRSCHMIDTP,etal.ThepropeptideisnotrequiredtoproducecatalyticallyactiveneutralproteasefromBacillusstearothermophilus[J].ProteinExpressionandPurification,2005,39:219-228.YATSUDAAP,BAKKERN,KRIJGSVELDJ,etal.IdentificationofsecretedcysteineproteasesfromtheparasiticnematodeHaemonchuscontortusdetectedbybiotinylatedinhibitors[J].InfectionandImmunity,2006,74(3):1989-1993.NILEGAONKARSS,ZAMBAREVP,KANEKARPP,etal.ProductionandpartialcharacterizationofdehairingproteasefromBacilluscereusMCMB-326[J].BioresourceTechnology,2007,98:1238-1245.程伟，吴丽华，徐亚磊，等.浓香型白酒酿造微生物研究进展[J].中国酿造，2014(3):1-4.CHENGW,WULH,XUYL,etal.ResearchprogressonbrewingmicrobesintheproductionprocessofLuzhou-flavorliquori[J].ChinaBrewing,2014(3):1-4.RAOMB,TANKSALEAM,GHATGEMS,etal.Molecularandbiotechnologicalaspectsofmicrobialproteases[J].MicrobiologyandMolecularBiologyReviews,1998,62(3):597-635.秦鹏，计成，郭宏.不同能量蛋白水平对褐壳蛋鸡生产性能的影响[J].饲料工业，2001,22(10):22-24.QINP,JIC,GUOH.Effectsofdifferente