高粱花叶病毒RT-PCR检测技术规程

1DB53/TXXXX—2022高粱花叶病毒RT-PCR检测技术规程本文件规定了高粱花叶病毒RT-PCR检测方法中涉及的仪器与耗材、试剂、检测样品的取样及对照设置、检测方法和结果判定等。本文件适用于高粱花叶病毒（Sorghummosaicvirus，SrMV）侵染的植物样品的RT-PCR检测。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1高粱花叶病毒Sorghummosaicvirus高粱花叶病毒（Sorghummosaicvirus，SrMV）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus），是引起甘蔗花叶病的主要病毒之一，英文名称为Sorghummosaicvirus，缩写为SrMV，参见附录A。3.2RT-PCR反转录聚合酶链式反应（ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction，RT-PCR）的简称，是一种在体外利用反转录酶将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，以获得RNA特定片段。4仪器与耗材4.1仪器主要仪器包含电子天平、恒温水浴锅、高速台式冷冻离心机、蛋白/核酸分析仪、PCR扩增仪、涡旋混匀器、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、可调微量移液器、研钵等。4.2耗材无核酸酶（Nuclease-free）的1.5mL和2.0mL离心管及0.2mLPCR管等。5试剂5.1常规试剂液氮、焦碳酸二乙酯（DEPC）灭菌水或者RNase-free水、植物总RNA提取试剂盒、三氯甲烷、70%乙醇、异丙醇、无水乙醇等。2DB53/TXXXX—20225.2RT-PCR试剂Oligo(dT)18引物（0.5µg/µL），RT-PCR反转录试剂盒，含溴酚蓝染料的2×EasyTaqPCRSuperMix聚合酶混合物。5.3引物5.3.1上游引物SrMV-F：5′-CATCARGCAGGRGGCGGYAC-3′，下游引物SrMV-R：5′-TTTCATCTGCATGTGGGCCTC-3′（R=A/G，Y=C/T）。5.3.2用无核酸酶的水将上、下游引物分别配制成浓度为20µM的水溶液。5.3.3目的扩增片段约为820bp。5.4电泳缓冲液的配制按以下步骤配制电泳缓冲液：a)称取242g的Tris，先用300mL的ddH2O搅拌溶解后，加100mL0.5mol/L的EDTA水溶液配制50×TAE储存液；b)用ddH2O将储存液稀释50倍配制1×TAE工作液；c)称取Tris108g、硼酸55g、7.44g的Na2EDTA·2H2O，加入40mL0.5mol/L的EDTA水溶液，再用ddH2O定容至1000mL配制10×TBE储存液；d)用ddH2O将储存液稀释20倍配制0.5×TBE工作液。5.5扩增产物电泳检测试剂1%左右（W/V）琼脂糖，核酸染料。6检测样品的取样及对照设置6.1阳性对照以SrMV侵染的植物样品作为阳性对照。6.2阴性对照以健康植物样品作为阴性对照。6.3空白对照以灭菌ddH2O作为空白对照。6.4取样戴一次性手套采集甘蔗叶片或芽作为待检样品，且每采一个样品跟换一次手套，过程中不应交叉污将采的集样品放入自封袋中，编号，冷藏运输到实验室液氮速冻后，于-80℃冰箱保存备用。7检测方法7.1总RNA提取总RNA提取步骤如下：3DB53/TXXXX—2022a)戴一次性手套称取0.1g待测样品置于灭菌研钵中，液氮冷冻，研磨至粉状后放入1.5mL离心管中，并对每支管进行编号；b)用核酸提取试剂盒提取样品总RNA，按提取试剂使用说明书进行操作；c)提取后用蛋白/核酸分析仪测定RNA相对浓度，当A260/A280比值为1.8～2.0时，可用于RT-PCR检测。7.2反转录按以下步骤进行反转录：a)以提取的总RNA为模板，在PCR管中按序依次加入：Oligo(dT)18引物约0.5µL、RNA模板约2.0μL（约200ng）、反转录试剂、灭菌DEPC水补足10μL反转录反应体系，混匀；b)2000rpm快速离心10s，放入PCR仪合成cDNA，按RT-PCR试剂盒说明书进行操作。7.3PCR扩增按以下步骤进行PCR扩增：a)以合成的cDNA第一链为模板，在PCR管中按序依次加入：灭菌DEPC水7.2μL、含溴酚蓝染料的2×EasyTaqPCRSuperMix聚合酶混合物10μL、反转录产物（cDNA）2.0μL、0.4μL上游引物SrMV-F（20μM）、0.4μL下游引物SrMV-R（20μM制成20μLPCR反应体系，2000rpm快速离心10s混匀后放进PCR仪进行PCR扩增；b)94℃预变性5min；c)94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；d)72℃延伸10min。7.4琼脂糖凝胶电泳检测按以下步骤进行：a)用1×TAE或0.5×TBE缓冲液配制1.0%左右（W/V）琼脂糖胶，加热至琼脂糖完全熔化；b)待凝胶冷却至50℃~60℃时，在100mL琼脂糖胶中加入适量的核酸染料，混匀；c)将凝胶倒入置有样品梳的制胶板上；d)待凝胶充分冷却后，拔除样品梳，将制胶板同制好的琼脂糖凝胶一并放入装有1×TAE或0.5×TBE电泳缓冲液的水平电泳槽；e)每个样品取10μLPCR扩增产物加入样品梳孔，在其中一个样品梳孔中加入6μLDNA分子量标准（MarkerE），130V恒定电压下电泳25min；f)电泳结束后，把胶板取出用凝胶成像仪观察、拍照。8结果判定阳性对照在820bp左右有条带，阴性对照和空白对照无条带，则检测结果有效。RT-PCR检测结果判定详见表1。4DB53/TXXXX—2022表1RT-PCR检测结果判定RT-PCR产物在820bp左右有无条带出现（参见1无无有有检测结果有效，被检测甘蔗样品感染高粱花2无无有无检测结果有效，被检测甘蔗样品未感染高粱3无检测结果无效，将实验中的所有试剂更换，测5DB53/TXXXX—2022（资料性）高粱花叶病毒A.1高粱花叶病毒高粱花叶病毒（Sorghummosaicvirus）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员，英文名称为Sorghummosaicvirus，缩写为SrMV。A.2病原特征A.2.1病毒粒体SrMV病毒粒体呈弯曲线状，无包膜，螺旋对称结构，大小为（750～850）nm×（13～15）nm。A.2.2基因组基因组由一条正单链RNA组成，大小约10kb，编码一个多聚蛋白，经蛋白酶水解后可产生10个成熟的蛋白质，从N端到C端依次是P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb和CP，还在P3氨基端编码区发生移码翻译出P3N-PIPO。A.3寄主在自然条件下，SrMV可侵染甘蔗（Saccharumoficinarum）、高粱（Sorghumbicolor）、玉米（Zeamays）和细叶芒（Miscanthussinensis）等禾本科植物。A.4病害症状SrMV侵染为害叶片，花叶症状主要表现在叶片上，尤以新叶基部症状最为明显；病毒可系统侵染，导致整丛蔗株发病，叶色褪绿，产生许多与叶脉平行的黄绿相间不规则条纹，大小长短不一，布满叶片，与正常部分参差间隔成“花叶”；病株生长差、矮化、分蘖少，汁液量减少。A.5传播途径SrMV可通过带毒的无性繁殖材料（种质）、田间病株及种传等方式传播，可通过收获机械、刀具和摩擦接种等方式传播，也可被多种蚜虫（甘蔗棉蚜Ceratovacunalanigera、黑豆蚜Aphiscraccivora、桃蚜Myzuspersicae和玉米蚜Rhopalsiphummaidis）以非持久方式传播。A.6分布主要分布于印度、美国、巴西、阿根廷