核酸全套课件

33.1733.13二、半胱氨酸-组氨酸锌指1、锌指结构是第一个被发现的真核细胞中同

DNA结合有关的结构，在细菌中十分少见。2、结构特点：有β发夹和一个相邻的α螺旋。以一对半胱氨酸和一对组氨酸在12个氨基酸残基组成的环中和锌离子配位。环状结构核心序列保守（C-X2-4-C-X2-4-F-X5-L-X2-H-X3-4-H),突出于蛋白表面，顶端碱性残基同DNA分子大沟作用。3、多个锌指同DNA结合，有的锌指作为隔离物，不同DNA

直接接触。锌指（zincfinger）基序蛋白来源指结合的DNA靶功能TFⅢA哺乳动物950bp5S基因5S基因转录因子SP1哺乳动物310bpGCbox一般的转录因子ADR1酵母222bpADH2基因激活ADH基因Kruppel果蝇5?？胚的分节驼背基因产物果蝇4+2?？胚的分节带有Cis/Hi锌指结构的转录因子和DNA结合蛋白ADR1:酿酒酵母的转录激活蛋白，表达醇脱氢酶ADH2等所需的DNA结合蛋白典型的锌指蛋白有一组锌指，单个的锌指的保守序列是：Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X2-His,根据锌结合位点的氨基酸又把锌指分成为2Cys/2His和2cys/2cys两类，前者为Ⅰ型，后者为Ⅱ型锌指，Ⅰ型结构“指”的本身由23aa组成，“指”与“指”之间通常由7-8aa连接。

锌指可形成

--helix插入大沟，与其相连接的

-sheet在另一侧糖皮质激素和雌激素受体都有两个“指”，每个指在Cys四分体的中央带有一个锌原子。两个指形成α-螺旋，彼此折叠成一个大的球状功能域。α-螺旋与螺旋相连的β折叠一道形成一个疏水中心。N-端螺旋的一侧和DNA的大沟接触，两个糖皮质激素受体形成二聚体和DNA结合，每个受体负责和连续的大沟接触。每个“指”控制着受体的重要特点。图表明在第一个“指”的右侧控制DNA的结合，在第二指的左侧控制着形成二聚体的能力。ViewoftheLacrepressorDNAcomplex,asdeterminedbyX-raycrystallography.Heretherepressortetramerisshownbindingtotwooperators.Eachdimerbindstooneoperator.Theoperatorsare21basepairslonghereandareshownindarkandlightblue.Themonomersarecoloredgreen,pink,red,andyellow.Notehowtheamino-terminalheadpieceononemonomer(pink)crossestheothermonomer(green)tobindthefirstpartoftheoperator,whereasthesecondmonomerheadpiece(green)crossesovertobindthesecondpartoftheoperator.Thus,therecognitionhelixfromeachoftwosubunitsbindstotheconsecutivepartsofthesameoperator.

爪蟾TFШA锌指结构域经典的锌指结构三、半胱氨酸锌指1、结构特点：含锌的DNA结合结构域只用半胱氨酸配位锌2、核受体家族的DNA结合结构（1）DNA结合结构为一个包含两相互垂直α螺旋的球形结构（2）以二聚体的形式结合DNA3、锌双核簇：酵母蛋白所特有，由6个半胱氨酸配位2个锌原子，具有保守序列C-X2-C-X6-C-X6-C-X2-C-X6-C表Cys2/Cys2型的调节蛋白蛋白大小指靶糖皮质激素受体94,0002GRE中20bp雌激素受体66,0002ERE中20bpGAL4(酵母)99,0001UAS中17bp腺病毒E1A～30,0001?

糖皮质激素受体-DNA复合物GAL-4的锌双合簇的结构（左：前视图；中：测视图右：俯视图（拉链作为二聚化结构）四、碱性结合结构域（bZIP及bHLH)

亮氨酸拉链（Leucineziipper）和螺旋-环-螺旋（HLH）1、结构特点：高度碱性的α螺旋作为同DNA的基本识别结构，螺旋通常以二聚体的形式存在，二聚化结构域一样为DNA

结合所必需。2、结合机制：碱性结构域在溶液中采用一种无序的部分螺旋结构，当同DNA结合时，这种结构发生了变化而诱导了典型α螺旋的形成。C-Jun和C-Fos蛋白的异二聚体的结合比它们同二聚体更为坚固。Myc，C/EBP（结合CAATbox和SV40核心增强子的一种因子），AP1蛋白（异二聚体，结合于SV40的增强子）等都具有亮氨酸拉链结构。

亮氨酸拉链（leucinezipper）结构域通常被定义为一行4-7个周期重复的亮氨酸残基，其距离大约跨越8个螺旋转弯，通式为L-x(6)-L-x(6)-L-x(6)-L，有时典型的亮氨酸残基会被异亮氨酸或缬氨酸所代替。结构分析发现亮氨酸拉链由平行的卷曲螺旋型α螺旋（coiled-coilα-helix）构成，它们通过亮氨酸侧链的疏水作用互相缠绕。GCN4二聚体结构小鼠Max蛋白螺旋一环一螺旋

（HLH，helix-loop-helix）有一条含有两个亲水的α-螺旋,链长为40～50aa，两个α-螺旋由很长的连接区（环）相连，螺旋的一侧有疏水氨基酸，两条链依赖疏水氨基酸的相互作用形成同二聚体或异二聚体，此螺旋区长约15～16aa，含有各种保守的残基，连接环的长度不等，一般为12-28aa。与DNA结合的是碱性区，长为15aa，其中有6aa为碱性。在HLH中带有碱性区的肽链称为碱性HLH（bHLH，proteim）。bHLH又分为两类：A类是可以广泛表达的蛋白，包括哺乳动物的E12/E47（可和免疫球蛋基因增强子中的元件结合）和果蝇da（daughterless,性别控制的总开关基因）的产物；B类是组织特异性表达的蛋白，包括哺乳动物的MyoD(肌浆蛋白（myogen）基因的转录因子)和果蝇的AC-S（achaete-scute无刚无基因的产物）这种bHLH可能是一种转录调控蛋白，大部分以异二聚体形式存在。类组蛋白结合模体五、1、核心组蛋白都有组蛋白折叠这样一个保守的结构，其包含两个介导二聚化的螺旋-链-螺旋结构2、许多转录因子于不同的核心组蛋白同源，如TAFs类组蛋白结合模体

真核细胞的DNA分子可通过同组蛋白作用被包装成核小体。在核小体的核心颗粒中包含有二个负超螺旋弯曲的DNA围绕着一个组蛋白的八聚体。这个八聚体分别由同样两个核心组蛋白H2A,H2B及H3，H4组成。它们同DNA之间的相互作用涉及DNA中富含AT区域的小沟存在于组蛋白八聚体的表面并将其缠绕。一级序列揭示：各组蛋白之间仅有很低的同源性(<20%)，但是它们具有一个保守的结构，即组蛋白折叠(histonefold)，它包含着由二个介导二聚化的融合的螺旋－链－螺旋的结构，组蛋白的连接子(如H1，H5)也在染色体的高度有序化中起作用。六、其他DNA结合基序1、乳头瘤病毒的E2蛋白包括4个β链和一个突出的α螺旋，二聚体形成β桶状结构2、通过β链识别（1）带-螺旋-螺旋在MetJ,Are,Mnt中发现，通过β折叠同DNA识别；（2）TATA结合蛋白以反平行的β链同DNA结合，β链结合

DNA的小沟。呈C字型包围DNAE2蛋白带-螺旋-螺旋模体TBP结构（上为前视图；下为俯视图）3、TheRel家族Rel同源结构域(RHB)包含由铰链区连接的免疫球蛋白折叠。Rel蛋白有形成二聚化的倾向4、DNA加工酶中的结合模体催化合成和拓扑修饰的酶以沟状或环状结构围绕DNA，限制性内切酶倾向于使DNA发生剧烈扭曲17.3蛋白中RNA结合模体一、RNP结构域1、结构特点：两种保守模体构成更大结构的一部分，大的结构由4个β链和两个α螺旋以β-α-β-β-α-β的拓扑结构组成,RNP1和RNP2模体位于一个四条β折叠的中心β

链处2、代表：U1A剪接体蛋白二、其他RNA结合模体1、双链RNA-结合结构域：拓扑结构类似于RNP结构域，但同

RNA的特异性结合仅发生于第二个α螺旋和β折叠形成的裂缝中2、K同源结构域3、其他U1剪接体蛋白N-端RNP结构域

17.4蛋白，核酸结合的分子基础一、核酸与蛋白的直接作用1、核酸蛋白直接作用的途径（1）蛋白侧链同碱基作用——序列特异性相互作用的主要形式；（2）蛋白主链同碱基作用；（3）蛋白侧链同磷酸骨架的作用；（4）蛋白主链同磷酸骨架的作用。2、存在于蛋白和核酸相互作用中的非共价相互作用：氢键、范德华力、疏水作用、静电作用及静电链、核酸自身的氢键、碱基堆积作用和蛋白氨基酸残基之间的吸引和排斥二、水在核酸蛋白相互作用中的作用1、负责结合反应的亲和力和特异性2、流动性增加了蛋白结合对接触面突变的适应性三、核酸结构的蛋白调节1、蛋白通过熔解碱基对，减小或增大弯折或螺旋来改变

DNA的结构。2、限制性内切酶造成最剧烈的扭曲和扭结3、DNA的柔性在转录和染色质结构形成中也有重要的作用四、二聚化和协同性1、二聚化的目的（1）通过增大结合蛋白的大小，增大接触面和碱基识别的数量；（2）通过增大蛋白同DNA结合的接触面，增加结合的稳定性；（3）通过可循环的蛋白与蛋白作用，增加作用的亲和力。2、二聚化的优点：通过形成异二聚体增加识别靶位点的范围，同时在调控中可使用非活性单体增加蛋白作用的多样性

3、二聚化对于bZIP和bHLH蛋白家族成员的作用（1）功能的多样性可由选择性的二聚化产生，如c-Fos和

c-Jun蛋白（2）调节的多样性可由选择性的二聚化产生，如MyoD1,

成肌素，Myf-5和MRF-4的活性调节

17.5序列特异性结合一、蛋白识别的DNA序列1、直接解读：涉及大沟或小沟处蛋白和碱基之间的相互作用，蛋白直接识别碱基。2、非直接解读：涉及蛋白和糖、磷酸骨架之间的相互作用，蛋白识别那些造成整个DNA特殊构象的序列。二、DNA中的分子信号:DNA碱基中由一种隐藏在键模式中的信号。在大沟处，成键基团模式对于每个碱基对是唯一的，因而在大沟出可以进行明确的序列解读；而在小沟处，成键模式是简并的，仅存在A/T和G/C之间的区别三、解读蛋白中的氨基酸1、结构域交换：在不同的蛋白中进行DNA结合结构域的交换2、部分结构域交换：可鉴定出DNA结合结构域中控制序列特异性的某些特定区域大沟侧小沟侧大沟侧小沟侧3、结构分析：通过X射线和NMR对蛋白-DNA复合体的结构进行分析，可以在原子分辨水平上确定分子内键的空间排列四、假定的锌指蛋白DNA识别密码1、一般而言，没有一套普遍的密码适用于所有序列特异性蛋白和DNA的相互作用2、对于一些Cys2His2锌指蛋白而言，它们同DNA的作用特点简单，总是几个同样的氨基酸链同碱基作用，如Zif2683、Zif268中的保守序列：Pro1(Tyr/Phe)2XCys4XXCys7XXXPhe11XX13XX15X16Leu17XX19His20XXXHis24StructureofthefirstzincfingerofZif268.Residues13,15,16and19areimplicatedinDNArecognition,inthiscasethebasetripletGCG.Thezincionisinthelowerrightportionofthestructureandischelatedbytwocysteinesandtwohistidines.五、序列特异性的RNA识别1、RNA在细胞中作用的多样化造成RNA-蛋白复合物结构的多样化2、氨基酰-tRNA合成酶同底物作用的方式I类tRNA合成酶与tRNA受体茎的小沟和反密码子环结合II类tRNA合成酶，在tRNA受体茎的大沟处和反密码子环结合17.6研究蛋白核酸相互作用的技术一、同蛋白作用的核苷酸序列的描述二、同核苷酸作用的蛋白质的纯化方法1、硝酸纤维素层析：利用RNA可结合于硝酸纤维素上，早期用于分离RNA结合蛋白2、亲和层析——高效分离DNA结合蛋白（1）寡核苷酸亲和纯化的基本要求

※确定最小的核酸结合序列

※隔开介质和识别序列的臂的长度

※固相化介质应具有适宜的液体流动性，从而允许蛋白或蛋白复合物接近核酸序列

技术

原理

用途凝胶阻滞分析DNA/RNA蛋白复合物比裸露的RNA或DNA的电泳迁移得慢鉴定和了解蛋白在DNA和RNA结合位点的特点DNA酶I足迹法结合有蛋白的DNA片段受到保护而不被降解鉴定被特殊蛋白占据的准确的核苷酸位点修饰保护结合DNA或RNA的蛋白可以保护特殊的碱基不被化学修饰鉴定同蛋白作用的特殊碱基修饰干涉碱基被化学修饰后通常不会结合蛋白了解同蛋白结合的特殊碱基※※※※混合

DNA

蛋白DNA

蛋白G

DNAG蛋白

阻滞条带※※足迹

凝胶阻滞分析DNA酶足迹法※※DNAaseI消化修饰mGmG※※※※GG※※mGG剪切剪切产物消失修饰保护修饰※GGGG有限的随机修饰※※※※GmGGGGGmGGGGGmGmGGGG从胶上切出，剪切独特的剪切产物修饰干涉（2）非特异性结合的基本解决方案

※利用一个非特异性寡聚核苷酸亲和预装柱，或用含有随机的或杂乱无序的核酸序列亲和柱

※在亲和柱内加入过量的非特异性寡核苷酸

※在已知与非特异性蛋白高亲和结合部位侧翼序列情况下，重新构建一个亲和柱，改变其高亲和部位的侧翼序列3、纯化的蛋白测序、设计核苷酸探针或引物，筛cDNA

文库分离对应于DNA结合蛋白的克隆并表达三、鉴定必需的核酸蛋白1、RNA-蛋白复合物结构的测定2、RNA-蛋白复合物功能的测定33.1733.13二、半胱氨酸-组氨酸锌指1、锌指结构是第一个被发现的真核细胞中同

DNA结合有关的结构，在细菌中十分少见。2、结构特点：有β发夹和一个相邻的α螺旋。以一对半胱氨酸和一对组氨酸在12个氨基酸残基组成的环中和锌离子配位。环状结构核心序列保守（C-X2-4-C-X2-4-F-X5-L-X2-H-X3-4-H),突出于蛋白表面，顶端碱性残基同DNA分子大沟作用。3、多个锌指同DNA结合，有的锌指作为隔离物，不同DNA

直接接触。锌指（zincfinger）基序蛋白来源指结合的DNA靶功能TFⅢA哺乳动物950bp5S基因5S基因转录因子SP1哺乳动物310bpGCbox一般的转录因子ADR1酵母222bpADH2基因激活ADH基因Kruppel果蝇5?？胚的分节驼背基因产物果蝇4+2?？胚的分节带有Cis/Hi锌指结构的转录因子和DNA结合蛋白ADR1:酿酒酵母的转录激活蛋白，表达醇脱氢酶ADH2等所需的DNA结合蛋白典型的锌指蛋白有一组锌指，单个的锌指的保守序列是：Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X2-His,根据锌结合位点的氨基酸又把锌指分成为2Cys/2His和2cys/2cys两类，前者为Ⅰ型，后者为Ⅱ型锌指，Ⅰ型结构“指”的本身由23aa组成，“指”与“指”之间通常由7-8aa连接。

锌指可形成

--helix插入大沟，与其相连接的

-sheet在另一侧糖皮质激素和雌激素受体都有两个“指”，每个指在Cys四分体的中央带有一个锌原子。两个指形成α-螺旋，彼此折叠成一个大的球状功能域。α-螺旋与螺旋相连的β折叠一道形成一个疏水中心。N-端螺旋的一侧和DNA的大沟接触，两个糖皮质激素受体形成二聚体和DNA结合，每个受体负责和连续的大沟接触。每个“指”控制着受体的重要特点。图表明在第一个“指”的右侧控制DNA的结合，在第二指的左侧控制着形成二聚体的能力。锌指结构

大约有200多种调节蛋白含锌指基序是最普遍的DNA结合结构，锌亦可稳定其它DNA结合蛋白。锌指蛋白为两条反平行β-折叠和一个α-螺旋组成，

β-折叠的两个Cys残基于α-螺旋的两个相近His残基与Zn配位结合形成锌指结构。一些非保守的残基决定每一区域的特异性。多数蛋白含多锌指结构域。

锌指结合于DNA大沟，与5bp序列呈平行结合。

ViewoftheLacrepressorDNAcomplex,asdeterminedbyX-raycrystallography.Heretherepressortetramerisshownbindingtotwooperators.Eachdimerbindstooneoperator.Theoperatorsare21basepairslonghereandareshownindarkandlightblue.Themonomersarecoloredgreen,pink,red,andyellow.Notehowtheamino-terminalheadpieceononemonomer(pink)crossestheothermonomer(green)tobindthefirstpartoftheoperator,whereasthesecondmonomerheadpiece(green)crossesovertobindthesecondpartoftheoperator.Thus,therecognitionhelixfromeachoftwosubunitsbindstotheconsecutivepartsofthesameoperator.

爪蟾TFШA锌指结构域经典的锌指结构三、半胱氨酸锌指1、结构特点：含锌的DNA结合结构域只用半胱氨酸配位锌2、核受体家族的DNA结合结构（1）DNA结合结构为一个包含两相互垂直α螺旋的球形结构（2）以二聚体的形式结合DNA3、锌双核簇：酵母蛋白所特有，由6个半胱氨酸配位2个锌原子，具有保守序列C-X2-C-X6-C-X6-C-X2-C-X6-C表Cys2/Cys2型的调节蛋白蛋白大小指靶糖皮质激素受体94,0002GRE中20bp雌激素受体66,0002ERE中20bpGAL4(酵母)99,0001UAS中17bp腺病毒E1A～30,0001?

糖皮质激素受体-DNA复合物GAL-4的锌双合簇的结构（左：前视图；中：测视图右：俯视图（拉链作为二聚化结构）HAP1proteinHAP1蛋白酿酒酵母的转录激活蛋白，对氧起应答反应。氧信号可激活HAP1与细胞色素c1的基因上游激活序列（UAS）相结合的能力，调节细胞色素c1基因的表达。在编码细胞色素c1的基因（CYC1）的引物调节区有HAP1的结合区。LAC9protein：乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）的调节蛋白，激活乳糖的代谢。功能与酿酒酵母的GAL-4蛋白类似，但序列差别大。调节乳糖和半乳糖调节子的活性。StructureofthefirstzincfingerofZif268.Residues13,15,16and19areimplicatedinDNArecognition,inthiscasethebasetripletGCG.Thezincionisinthelowerrightportionofthestructureandischelatedbytwocysteinesandtwohistidines.锌指样（zincfinger-like）

的DNA模体序列分析发现dsx和mab-3的产物都具有锌指样（zincfinger-like）模体（包含保守的半胱氨酸和组氨酸残基鳌合锌，但与通常的锌结合模体的序列不同），称为DM域。并且两个基因产物有几个相关的调节功能：都直接调节卵黄蛋白基因（yolkproteingene）的转录；都是雄性专一器官分化所必需；都介导雄性交配行为（matingbehavior）；

1998年Raymond等人发现从线虫中分离的mab-3基因编码的蛋白与果蝇的性别决定基因dsx基因编码的蛋白具有相似的DNA结合模体（DNA-bindingmotif），并且，用dsx基因重建了线虫mab-3(‘maleabnormal3’),缺失突变体的性别分化，这个模体称为DM功能域（DMdomain）。同时，他们鉴定出了人类9号染色体短臂末端同样有一个基因编码的蛋白具有相似的结构域，他们称其为DMT1，后称DMRT1（DrosophilaDoublesexandC.elegans

Mab-3RelatedTranscriptionfactor）。脊椎动物同样有包含DM功能域的基因。通过荧光原位分子杂交（FISH）技术将人类DMRT1基因定位在9号染色体短臂末端9p24.3。人类九号染色体短臂末端片段（9p21-9p24）的删除将会导致高频率的不可逆的46XY个体性翻转为女性表型，称为9p缺失症（9pdeletionsyndrome）。

四、碱性结合结构域（bZIP及bHLH)

亮氨酸拉链（Leucineziipper）和螺旋-环-螺旋（HLH）

1、结构特点：高度碱性的α螺旋作为同DNA的基本识别结构，螺旋通常以二聚体的形式存在，二聚化结构域一样为DNA结合所必需。

2、结合机制：碱性结构域在溶液中采用一种无序的部分螺旋结构，与DNA结合时，这种结构发生了变化而诱导了典型α螺旋的形成。亮氨酸拉链（Leucineziipper）和螺旋-环-螺旋（HLH）亮氨酸拉链（leucinezipper）结构域是一种富含亮氨酸的α螺旋链形成的二聚体模体。一个亲水的α-螺旋在其表面的一侧有疏水基团（包括亮氨酸），在肽链上相隔7个氨基酸就出现一个Leu（通常四或五个亮氨酸），这样使Leu在α-螺旋中排列成一条直线。有时典型的亮氨酸残基会被异亮氨酸或缬氨酸所代替。端部的两个α螺旋含有很多的Lys和Arg。由leucinezipper将其插入DNA的两个大沟内。含leucinezipper调节蛋白在正常细胞中行使重要功能，其也在一些非调节蛋白中存在。Leucinezipper可将含helix-turn-helix和zincfinger的调节蛋白连接在一起。很多原癌基因，例如c-jun

和c-fos都编码亮氨酸拉链蛋白，它们本身相互作用，形成同二聚体或异二聚体。GCN4二聚体结构小鼠Max蛋白basichelix-loop-helixleucniezipper蛋白，称为Max，能特异地同myc蛋白结合，成为myc－Max复合体，结合于DNA的CACGTG区。螺旋一环一螺旋

（HLH，helix-loop-helix）有一条含有两个亲水的α-螺旋,链长为40～50aa，两个α-螺旋由很长的连接区（环）相连，螺旋的一侧有疏水氨基酸，两条链依赖疏水氨基酸的相互作用形成同二聚体或异二聚体，此螺旋区长约15～16aa，含有各种保守的残基，连接环的长度不等，一般为12-28aa。与DNA结合的是碱性区，长为15aa，其中有6aa为碱性。在HLH中带有碱性区的肽链称为碱性HLH（bHLH，proteim）。bHLH又分为两类：A类是可以广泛表达的蛋白，包括哺乳动物的E12/E47（可和免疫球蛋基因增强子中的元件结合）和果蝇da（daughterless,性别控制的总开关基因）的产物；B类是组织特异性表达的蛋白，包括哺乳动物的MyoD(肌浆蛋白myogen）基因的转录因子)和果蝇的AC-S（achaete-scute无刚无基因的产物）这种bHLH可能是一种转录调控蛋白，大部分以异二聚体形式存在。1、核心组蛋白H2A,H2B,H3,H4都有组蛋白折叠（histonefoldmotif,HFM）这样一个保守的结构，其包含两个介导二聚化的螺旋-链-螺旋结构。2、NF-YB、C亚基含有65个氨基酸的HFM；3、TAFs（TFIID

）也含有HFM；类组蛋白结合模体核因子Y(nuclearfactorY,NF-Y)也称作

CBF(CCAATboxbindingfactor),CPI,是结合

CCAAT盒的转录因子。它能识别真核基因启

动子区域的5’-CTGATFGGYYRR-3’或5’-YYR-RCCAATCAG-3’共有序列。有功能的NF-Y是一个异源三聚体蛋白,它包含三个不同的亚单位A,B,C。细胞衰老是由细胞分裂的次数决定的。NF-Y正是通过与G1/S期基因启动子区域的多聚CCAA,盒或E2F位点结合而对基因进行调控,从而在细胞的衰老中发挥作用。

E2F转录因子最初作为腺病毒E2启动子的活化剂被发现，目前已发现5个不同的E2F家族成员，从E2F-1到E2F-5。它们通过调节控制细胞DNA合成及与细胞增殖有关的基因表达而调控细胞周期。在细胞周期中Rb磷酸化受到调控

G0/G1去磷酸化，G1末至G2末被细胞周期蛋白CDK复合物磷酸化。非磷酸化的Rb可结合转录因子E2F及许多肿瘤抗原。

肿瘤抗原(SV40T,AdE1A)和Rb结合Rb(retinoblastoma)Rb(retinoblastoma)

视网膜母细胞瘤

转录因子转录复合体

TBPTAFsTFIIATFIIBTFIIFPolIITFIIERNApolⅡ的转录起始HIT模体（HITmotif）

HumanFhit(Ap3Ahydrolase)withtwoAp3A(二腺嘌呤三磷酸)analog

molecules

组氨酸三联体结构（Histriad）Fhit(fragile

Histriad)(脆性组氨酸三联体)脆性组氨酸三联体（FHIT）基因是1996年由Ohta等克隆的一个位于3p14.2区域的候选抑癌基因（1）和肿瘤有关：脆性组氨酸三联体基因异常转录与肝癌关系横纹肌肉瘤脆性组氨酸三联体蛋白的表达子宫颈上皮内瘤变组织脆性组氨酸三联体基因表达组氨酸三联体基因(FHIT)的缺失在食管癌发生、发展中的作用肝内胆管癌可能与FHIT基因突变有关（2）和鸟类的性别决定有关HIT酶是鸟类向雌性分化的抑制物雄性（ZZ）胚胎中没有ASW/WPKCI，只有ZPKCI，其编码的蛋白形成同二聚体，具有HIT酶活性，从而抑制了胚胎向雌性分化；相反，雌性胚胎中ASW/WPKCI蛋白与Z上的同源基因ZPKCI编码的蛋白形成异二聚体，ASW/WPKCI蛋白干扰了ZPKCI蛋白的活性从而抑制了HIT酶的活性，在雌性中ASW/WPKCI的表达量远高于ZPKCI，因此在雌性胚胎中几乎没有HIT酶的活性，从而开启了向雌性分化的通路。ASW（Acain,Sex-specific,W-linked）

WPKCI（PKCinhibitor）1、乳头瘤病毒的E2蛋白六、其他DNA结合模体包括4个β链和一个突出的α螺旋，二聚体形成β桶状结构2、通过β链识别（1）带-螺旋-螺旋在三种细菌阻遏物MetJ,Arc,Mnt中发现通过β折叠同DNA识别；

TBP结构（上为前视图；下为俯视图）（2）TBP（TATA结合蛋白）以反向平行的β链同DNA结合，β链结合DNA的小沟。呈C字型包围DNA

3、TheRel家族Rel同源结构域(relhomologydomain,RHD)它全长包括大约300个氨基酸残基，包含着由一个铰链区连接二个免疫球蛋白折叠构成。其中的一个折叠负责二聚化，另一个是同序列特异DNA相互作用。

Rel蛋白可以形成同二聚体和不同的异二聚体，都具有二聚化的倾向。

NF-κB是属于Rel家族的转录因子，参与调节与机体免疫、炎症反应、细胞分化有关的基因转录。哺乳动物细胞中有五种NF-κB/Rel：RelA(P65)，RelB，C-Rel，NF-κB1(P50)、NF-κB2(P52)，都具有Rel同源区(Relhomologydomain，RHD)，能形成同或异二聚体，启动不同的基因转录。蛋白中RNA结合模体一、RNP结构域1、结构特点：两种保守模体构成更大结构的一部分，大的结构由4个β链和两个α螺旋以β-α-β-β-α-β的拓扑结构组成,RNP1和RNP2模体位于一个四条β折叠的中心β链处U1剪接体蛋白N-端RNP结构域二、其他RNA结合模体1、双链RNA-结合结构域：拓扑结构类似于RNP结构域，但同RNA的特异性结合仅发生于第二个α螺旋和β折叠形成的裂缝中2、K同源结构域在核不均一RNA结合蛋白hnRNPK（HeterogeneousnuclearribonucleoproteinK）中发现，这个蛋白含有三个这种结构域。在几种其它的RNA结合蛋白，其中包括脆性-X基因－FMR1的产物中也发现了这种结构。同dsRBD一样，K同源结构域以三个链组成

-折叠中心，但是它们还有三个α螺旋(组成为

-

-

-

-

-

)，RNA和头两个

螺旋连接区的残基之间产生特异性相互作用。蛋白，核酸结合的分子基础一、核酸与蛋白的直接作用1、核酸蛋白直接作用的途径（1）蛋白侧链同碱基作用——序列特异性相互作用的主要形式；（2）蛋白主链同碱基作用；（3）蛋白侧链同磷酸骨架的作用；（4）蛋白主链同磷酸骨架的作用。2、存在于蛋白和核酸相互作用中的非共价相互作用：氢键、范德华力、疏水作用、静电作用及静电链、核酸自身的氢键、碱基堆积作用和蛋白氨基酸残基之间的吸引和排斥二、水在核酸蛋白相互作用中的作用1、负责结合反应的亲和力和特异性2、流动性增加了蛋白结合对接触面突变的适应性三、核酸结构的蛋白调节1、蛋白通过熔解碱基对，减小或增大弯曲或螺旋来改变DNA的结构。2、限制性内切酶造成最剧烈的扭曲和扭结3、DNA的柔性在转录和染色质结构形成中也有重要的作用

四、二聚化和协同性1、二聚化的目的（1）通过增大结合蛋白的大小，增大接触面和碱基识别的数量；（2）通过增大蛋白同DNA结合的接触面，增加结合的稳定性；（3）通过可循环的蛋白与蛋白作用，增加作用的亲和力。2、二聚化的优点：通过形成异二聚体增加识别靶位点的范围，同时在调控中可使用非活性单体增加蛋白作用的多样性3、二聚化对于bZIP和bHLH蛋白家族成员的作用（1）功能的多样性可由选择性的二聚化产生，如c-Fos和c-Jun蛋白（2）调节的多样性可由选择性的二聚化产生，如MyoD1,成肌素，Myf-5和MRF-4的活性调节

17.5序列特异性结合一、蛋白识别的DNA序列1、直接解读：涉及大沟或小沟处蛋白和碱基之间的相互作用，蛋白直接识别碱基。2、非直接解读：涉及蛋白和糖、磷酸骨架之间的相互作用，蛋白识别那些造成整个DNA特殊构象的序列。二、DNA中的分子信号:DNA碱基中由一种隐藏在键模式中的信号。在大沟处，成键基团模式对于每个碱基对是唯一的，因而在大沟出可以进行明确的序列解读；而在小沟处，成键模式是简并的，仅存在A/T和G/C之间的区别三、解读蛋白中的氨基酸1、结构域交换：在不同的蛋白中进行DNA结合结构域的交换2、部分结构域交换：可鉴定出DNA结合结构域中控制序列特异性的某些特定区域大沟侧小沟侧大沟侧小沟侧3、结构分析：通过X射线和NMR对蛋白-DNA复合体的结构进行分析，可以在原子分辨水平上确定分子内键的空间排列四、假定的锌指蛋白DNA识别密码1、一般而言，没有一套普遍的密码适用于所有序列特异性蛋白和DNA的相互作用2、对于一些Cys2His2锌指蛋白而言，它们同DNA的作用特点简单，总是几个同样的氨基酸链同碱基作用，如Zif2683、Zif268中的保守序列：Pro1(Tyr/Phe)2XCys4XXCys7XXXPhe11XX13XX15X16Leu17XX19His20XXXHis24五、序列特异性的RNA识别1、RNA在细胞中作用的多样化造成RNA-蛋白复合物结构的多样化2、氨基酰-tRNA合成酶同底物作用的方式I类tRNA合成酶与tRNA受体茎的小沟和反密码子环结合II类tRNA合成酶，在tRNA受体茎的大沟处和反密码子环结合17.6研究蛋白核酸相互作用的技术一、同蛋白作用的核苷酸序列的描述二、同核苷酸作用的蛋白质的纯化方法1、硝酸纤维素层析：利用RNA可结合于硝酸纤维素上，早期用于分离RNA结合蛋白2、亲和层析——高效分离DNA结合蛋白（1）寡核苷酸亲和纯化的基本要求

※确定最小的核酸结合序列

※隔开介质和识别序列的臂的长度

※固相化介质应具有适宜的液体流动性，从而允许蛋白或蛋白复合物接近核酸序列

技术

原理

用途凝胶阻滞分析DNA/RNA蛋白复合物比裸露的RNA或DNA的电泳迁移得慢鉴定和了解蛋白在DNA和RNA结合位点的特点DNA酶I足迹法结合有蛋白的DNA片段受到保护而不被降解鉴定被特殊蛋白占据的准确的核苷酸位点修饰保护结合DNA或RNA的蛋白可以保护特殊的碱基不被化学修饰鉴定同蛋白作用的特殊碱基修饰干涉碱基被化学修饰后通常不会结合蛋白了解同蛋白结合的特殊碱基混合

DNA

蛋白DNA

蛋白G

DNAG蛋白

阻滞条带足迹

凝胶阻滞分析DNA酶足迹法DNAaseI消化修饰mGmGGGmGG哌叮剪切剪切产物消失DMS保护修饰GGGG有限的随机修饰GmGGGGGmGGGGGmGmGGGG从胶上切出独特的剪切产物修饰干涉修饰的片段出现在非阻滞的带剪切不切（2）非特异性结合的基本解决方案

※利用一个非特异性寡聚核苷酸亲和预装柱，或用含有随机的或杂乱无序的核酸序列亲和柱

※在亲和柱内加入过量的非特异性寡核苷酸

※在已知与非特异性蛋白高亲和结合部位侧翼序列情况下，重新构建一个亲和柱，改变其高亲和部位的侧翼序列3、纯化的蛋白测序、设计核苷酸探针或引物，筛cDNA

文库分离对应于DNA结合蛋白的克隆并表达三、鉴定必需的核酸蛋白1、RNA-蛋白复合物结构的测定2、RNA-蛋白复合物功能的测定信号传导信号与物质、能量一样都是生命的基本要素。通讯能力是细胞具有的特性之一，细胞通讯可以通过信息的传递和接受着之间信号的交换而发生。单细胞生物在受到各种物理信号作用时需要作出相应的反应以利生存;多细胞生物的存活更有赖于细胞间的信号的交流和协调。内容提要4、信号转导通路的意义和应用3、信号转导通路的交叉与串话2、信号转导通路1、信号与受体（1）信号接受与跨膜转导（2）信号放大与胞内转导（3）信号交付信号与受体使细胞通过重新组织他们的结构、调节蛋白的活性和改变基因的表达模式来对环境作出反应的刺激。细胞中接受信号的分子。信号：受体：按化学性质分：（1）多肽和蛋白质激素（2）多肽生长因子（3）甾体激素（4）神经递质（5）小分子化合物1、物理信号：如光、热等2、化学信号总体可分为两类：一、信号信号分子的例子1.激素：肾上腺素酪氨酸衍生物皮质醇类固醇雌二酮类固醇胰高血糖素肽睾酮类固醇甲状腺素酪氨酸衍生物

2.局部介质：表皮生长因子（EGF）蛋白质血小板衍生生长因子（PDGF）蛋白质神经生长因子(NGF)蛋白质组胺组氨酸衍生物一氧化氮（NO）可溶性气体3.神经递质：乙酰胆碱胆碱的衍生物γ-氨基丁酸谷氨酸衍生物4.信号分子接触依赖的Δ

跨膜蛋白（一）按作用的距离分：（1）旁分泌信号(paracrine)（2）内分泌信号(autocrine)（3）近分泌信号(endocrine)按溶解性分:(1)亲脂性(2)亲水性内分泌产生的激素分泌到血流，能广泛分布到生物体全身旁分泌信号由细胞释放至它们附近的细胞介质中并起局部作用旁分泌发信号的细胞局部介质靶细胞神经元信号沿轴突传至远距离的靶细胞神经元的突触轴突神经递质细胞体靶细胞神经元接触依赖的信号传递需要细胞相互间膜与膜的直接接触。许多相同类型的信号分子用于内分泌、旁分泌和神经元的信号传递。其重要的差别在于向靶细胞传送信号时所用的速度和选择性

依赖接触的靶细胞发信号的细胞与膜结合的信号分子（二）按照信号引起的细胞生物效应分

1调节细胞增殖的信号：

2促进细胞分化的信号：

3促进细胞凋亡的信号：

4调节细胞代谢和功能的信号：

5诱发细胞应激反应的信号：许多细胞需要多重信号（绿色箭头）以求存活；另外的信号（红色箭头）为细胞分裂所需；还有一些其他信号（黑色箭头），是分化所需的；如去处适当的信号，大部分细胞会导致凋亡。相同的信号分子能诱导

不同靶细胞的不同反应不同细胞类型特化成以不同方式

对神经递质乙酰胆碱起反应。在（A），(B)中信号分子结合类似的受体蛋白，但在功能各异不同的特化细胞中激起不同的反应。在图中，细胞对同一信号产生不同类型的受体蛋白。而不同类型的受体会产生完全不同的细胞内信号，因此不同类型的肌细胞对乙酰胆碱有不同的反应。二、受体1、核受体2、膜受体（1）离子通道偶联受体(channellinkedreceptor)

（2）G蛋白偶联受体(G-proteinlinkedreceptor)（3）酶联受体(enzymelinkedreceptor)

（4）其它非酶联受体大致分二类：1、核受体：脂溶性信息分子与核受体结合启动靶基因转录的过程。（分布于胞浆或核内的受体，本质上都是配体调控的转录因子，均在核内启动信号转导并影响基因转录，故称为核受体）。

细胞内受体小的疏水信号分子细胞内受体类固醇激素皮质醇通过激活一个基因调控蛋白而起作用一氧化氮（NO）对血管平滑肌的松弛作用血管壁神经末梢释放的乙酰胆碱激活了血管壁衬里的内皮细胞产生和释放NO。NO从内皮细胞扩散出来，进入邻近的平滑肌细胞，引起肌细胞松弛。2、膜受体

:膜外配基结合区,跨膜区,胞内区膜受体的种类:（1）

离子通道偶联受体

（2）

G蛋白偶联型受体

（3）

酶联受体：

受体酪氨酸蛋白激酶（RTK）非受体型酪氨酸蛋白激酶（PTK）连接的受体丝/苏氨酸蛋白激酶（PSTK）型受体鸟苷酸环化酶受体

细胞表面受体细胞表面受体亲水信号分子质膜（1）、离子通道离子孔道可以分成

电压活化型

(voltage-activated)孔道、配体活化型

(ligand-activated)孔道

及第二信使门控通道。电压活化型孔道的开启受离子孔道所处的细胞膜电位调控。Vm=Vi-VoVmVm代表膜电位(membranevoltage)Vi和

Vo

分别是膜内和膜外的电位。细胞处於静止状态(restingstate)时，Vm是负值，大约在-50mV至-80mV之间。电压活化型钙离子孔道在这个范围内开启的机率很小。Vm越大时(即膜内的电位越高)，它的开启机率越大。

当肌肉细胞或神经细胞被活化时，膜电位会高到+50mV左右，此时这类钙离子孔道开启的机率接近100%。於是钙离子泳入细胞内，引起肌肉的收缩，神经突触的传导等等。另外，其他离子进出细胞膜亦会影响膜电位。譬如带正电的K+

由膜内流向膜外，会使膜电位降低；Na+

由膜外进入膜内会使膜电位升高。

配体活化型孔道的开启机率受配体调控。譬如IP3敏感型孔道无IP3作用时处於关闭状态。IP3从膜外与它结合后就可打开，让Ca2+

从内质网流入细胞溶质。Ca2+与IP3在膜外联合更能增加IP3敏感型孔道的开启机率。因此，这孔道一但被IP3开启，流入细胞质的Ca2+即迅速增加，直到IP3被特定的磷酸酶去磷酸化而失活。另一方面，位於细胞膜的Ca2+-ATPase(Ca2+pump)亦会将细胞质的Ca2+输送至细胞外，维持静止状态时的浓度。

膜电位如何调控离子孔道的开启机率？为何配体与离子孔道结合即能开启孔道？目前研究人员对离子孔道的启闭机制(gatingmechanism)所知甚少。不过，对离子孔道的选择性(selectivity)已有相当了解。

2003年诺贝尔化学奖彼得·阿格雷（PeterAgre）彼得·阿格雷1949年出生，毕业于明尼阿波利斯奥格斯堡学院，1974年在约翰斯·霍普金斯大学医学院获医学博士学位。自1993年起，他一直担任约翰斯·霍普金斯大学医学院生物化学教授和医学教授。

２０世纪８０年代中期，彼得·阿格雷研究了不同的细胞膜蛋白，经过反复研究，他发现一种被称为水通道蛋白的细胞膜蛋白就是人们寻找已久的水通道。为了验证自己的发现，阿格雷把含有水通道蛋白的细胞和去除了这种蛋白的细胞进行了对比试验，结果前者能够吸水，后者不能。为进一步验证，他又制造了两种人造细胞膜，一种含有水通道蛋白，一种则不含这种蛋白。他将这两种人造细胞膜分别做成泡状物，然后放在水中，结果第一种泡状物吸收了很多水而膨胀，第二种则没有变化。这些充分说明水通道蛋白具有吸收水分子的功能，就是水通道。现年47岁的罗德里克·麦金农(RoderickMacKinnon)1978年他在波士顿布兰代斯大学获学士学位，1982年在波士顿塔夫茨大学医学院获医学博士学位。自1996年起，他一直担任纽约洛克菲勒大学分子神经生物学教授。

１９８８年，罗德里克·麦金农利用Ｘ射线晶体成像技术获得了世界第一张离子通道的高清晰度照片，并第一次从原子层次揭示了离子通道的工作原理。这张照片上的离子通道取自青链霉菌，也是一种蛋白。麦金农的方法是革命性的，它可以让科学家观测离子在进入离子通道前的状态，在通道中的状态，以及穿过通道后的状态。对水通道和离子通道的研究意义重大。钾通道模型蓝色：正电荷白色：中性红色：副电荷黄色：疏水性离子通道偶联受体(channellinkedreceptor)受体和它的配体结合，并对此作出反应离子通道偶联受体质膜离子信号分子膜转运蛋白分为两类：载体蛋白和通道蛋白载体蛋白进行一系列构象变化转运小的水溶性的有机分子和无机离子。通道蛋白不同，它在膜中形成极小的亲水孔，使特殊的无机离子经过亲水孔扩散。通道蛋白转运速率要比载体蛋白快得多。离子通道既能以开放又能以关闭得构象存在，但只有在开放构象时转运。它们的开放和关闭通常由细胞外刺激或胞内条件调控。除了脂溶性的不带电荷的分子能以简单扩散的方式直接通过脂双层外，几乎所有的小有机分子穿越细胞膜都需要载体蛋白。每个细胞膜有它自己的一套载体蛋白载体蛋白的三维结构盐生盐杆菌（Halobacteriumhalobius）的紫膜质，它应答光，把H＋泵出细菌，由共价连接的吸收光的基团（视黄醛）捕捉H＋。该多肽以7个α螺旋穿越脂双层。质子所经途径可避免接触脂双层载体蛋白和通道蛋白的主要区别是辨别溶质的方式。通道蛋白是根据分子的大小和电荷。载体蛋白是根据能否特异结合。通道蛋白仅承担被动运输，而载体蛋白还承担主动运输。电化学梯度的两种组成部分：溶质浓度梯度和跨膜电压。二者之和成为离子穿越膜的净驱动力。图示相同正电荷溶质在三种不同情况下的电化学梯度量值。（A）仅有梯度浓度；（B）浓度梯度加膜电位；（C）膜电位减小，由浓度梯度产生驱动力。驱动主动转运的三种方式黄色表示转运分子，红色表示能源载体蛋白以两种构象状态存在：状态A，溶质的结合部位暴露于膜外；状态B,溶质的结合部位暴露于膜内。这两种状态随机发生，与溶质是否被结合无关，完全可逆。若膜外溶质浓度较高，则采用A→B>B→A。Na+-K+泵。该载体蛋白是一种ATP酶，能水解ATP释放能逆电化学梯度量把钠离子泵出细胞，钾离子泵入细胞。鸟本苷是与该泵结合以达到抑制泵活性的药物。南非的Blyde河水闸，利用势能作驱动。离子梯度同样被用作驱动钠钾泵的泵循环图解模型1.Na+的结合及随后在泵的胞质面由ATP进行的磷酸化；2.引起蛋白质发生构象的变化，转运Na+穿运膜并释放到胞外；3.磷酸基连接到蛋白质的高能键提供能量驱动构象变化；4.细胞外表面K+的结合5.随后的去磷酸化，6.使蛋白质恢复原来的构象，这样K+转运穿越膜并释放到胞内。

在哺乳动物细胞的真实泵中有3个Na+和2个K+结合部位。因此，该泵的一个循环的净结果是转运3个Na+到胞外，和2个K+到胞内。载体蛋白的三种转运类型：单向转运（转运一种溶质）；偶联转运（一种溶质的转运依赖与于同时或相继的另一种溶质的转运）。后者又分为同向转运和对向转运。Na+梯度能驱动葡萄糖泵的一种原则上的方式。该泵以两种交替状态A和B之间随机往返。A状态下，蛋白质向胞外空间开放；B状态下则向胞内溶质开放。在两种状态下Na+和葡萄糖与蛋白质的结合率都一样，但只有在两者同时存在的情况下它们才有效地结合。Na+的结合，引起蛋白质构象的改变，极大地增加蛋白质对葡萄糖的亲和力，反之亦然。能使肠上皮细胞转运葡萄糖穿过肠内衬的两种载体类型。顶端表面，由Na+驱动的葡萄糖同向转运，主动转运葡萄糖进入细胞；在基底面和侧面，由被动的葡萄糖单向转运，使葡萄糖沿其浓度梯度下行而释放到胞内动植物细胞内载体介导溶质转运的一些异同点。由Na+-K+泵产生的电化学梯度，常被用于驱动主动转运溶质穿越动物细胞质膜；通常由H+ATP酶产生的H+电化学梯度常被植物细胞、细菌、真菌（包括酵母）用于此目的。有些离子孔道的开启机率G蛋白(Gα或Gβγ)调控，包括钾离子孔道，钙离子孔道及钠离子孔道。电压活化型及G蛋白活化的钾离子孔道皆由四个亚单元组成。不过前者每一个亚单元含有六跨膜段，后者每一个亚单元仅含两个跨膜段。电压活化型钙离子及钠离子孔道的主要亚基的跨膜结构。

离子通道

nAChR孔道的概要结构。

(a)侧面图。(b)俯视图。(c)一个亚基的跨膜构形。M2围成孔径。nAChR孔道含五个亚基，其活化需两个α

亚基与两个乙酰胆硷分子结合。nAChR乙酰胆碱(acetylcholine)的菸碱酸受体所形成的离子孔道

离子通道的结构

肌肉细胞质膜内的离子通道，当由神经递质乙酰胆碱与通道结合时，该通道开放。此离子通道由5个跨膜蛋白亚基组成，这些亚基结合组成脂双层的水孔。每个亚基由一个跨膜α构成。孔两端带负电荷的氨基酸侧链保证了只有带正电荷的离子才能通过，主要指Na+和K+。当通道处在关闭构象时，在被称为门的区域内，疏水氨基酸测链将此孔堵塞；当与乙酰胆碱结合时，蛋白质构象发生变化，这些侧链移开门被打开，容许Na+和K+穿过膜，降低其电化学梯度。捕蝇草。当一个昆虫在上面移动时，叶子在半秒钟内急速关闭。每片叶子中央的三根触毛中任何两根连续遭到碰触，就会触发这一反应。离子通道的开放和由此引发（机制不清）电信号，导致膨压迅速变化而关闭叶子。膜片钳记录技术。用微电极简则可以用与细胞相连的膜片（A）,也可用分离的膜片（B）进行。分离膜片的优点是容易改变膜两侧的溶液成分，测试各种溶质对通道行为的效应用膜片钳技术记录到的单离子通道电流。本例来自肌肉细胞并含有一个单通道蛋白。当乙酰胆碱结合在通道的外表面时，离子通道打开,允许阳离子通过，但出现间隙性开放。图示通道开放3次，每次时距不同。如乙酰胆碱不与通道结合，则通道不开放。门控离子通道。通道闸门取决于离子通道的种类，它响应于跨膜电压差的改（A）、化学配体在细胞外（B）或内（C）的通道结合、机械刺激（D）。

应力激活的离子通道如何使我们听到声音。穿过柯替氏器的切面通过内耳耳蜗轴。每个毛细胞在它上端表面有一簇叫静纤毛的突起，这些毛细胞嵌入支持细胞层内，这一支持细胞层夹在下面基底膜与上面覆膜之间声音振动引起基底膜上下振动从而使静纤毛纤毛倾斜。每个毛细胞上交错排列的每根静纤毛，借助于很细的丝与邻近较短的静纤毛相连。由于静纤毛的倾斜，拉动丝，因而拉开静纤毛膜上的应力激活离子通道，使周围溶液中的带正电荷例子离子进入细胞。离子的输入激活毛细胞，这就刺激位于下面的把听觉信号传递给大脑的神经细胞。含羞草的关叶反应。叶子被碰触后几秒钟，这些小叶下垂。这一反应包括电压门控离子通道的打开，产生电脉冲。当脉冲抵达每片小叶底部特化的铰链细胞时，这些细胞迅速失水，引起小叶突然下垂，进一步使叶柄下垂。离子的分布产生膜电位。膜电位是由接近膜的一薄层（小于1nm）离子产生，这些离子通过对膜另一边带相反电荷的对方的电吸引而处在应有的位置上，产生膜电位所需的跨膜离子只占其极少部分。膜两侧电荷正好平衡，由负电荷抵消正电荷，膜电位＝0少数阳离子（红色）穿过膜从右到左，留下它们的阴离子（红色），建立起非零膜电位。由K＋浓度梯度产生的驱动力由电压梯度产生的驱动力关闭的K＋通道，膜电位＝0；细胞内K＋比细胞外多，但每侧净电荷为零（正负电荷相等）K＋通道打开，K＋移出，留下阴离子，这种电荷分布产生膜电位平衡K＋向外迁移的倾向假设膜电位从零开始，然后K＋将趋向于由K＋泄漏通道向胞外移动，降低其浓度剃度。假定膜含有的通道不让其他离子通过，而只让K＋离子通过，但因阴离子也不随K＋离子通过，结果膜外有过多的正电荷、膜内有过多的负电荷产生，导致膜电位升高，并趋向驱动K＋