发酵工艺原理课件

生物工程概述基因工程基因工程是通过DNA重组技术,对生物材料进行改良,构建出新型的微生物菌株、培育出新的动植物品种,使其具有优良的符合人们意愿的性状，或获得所需要的产物。

稀少珍贵的蛋白质药物1982年，美国食品与药物管理局批准了首例基因工程产品—人胰岛素投放市场——它标志了基因工程产品正式进入到商业化阶段。人生长激素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、a-干扰素、纤维素酶、抗血友病因子、红细胞生成素、尿激酶原、白细胞介素-2、集落刺激因子、乙肝疫苗等等

畜牧业中的应用动物疫苗、生长激素等例：动物乳腺反应器

种植业中的应用用携带外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生质体，使外源DNA与植物染色体DNA整合，通过原生质体的培养分化成愈伤组织，最后发育成具有新性状的完整植株—转基因植物

种植业中的应用抗化学除草剂基因转基因西红柿蛋白质工程：通过对蛋白质分子结构的合理设计，利用基因工程的手段生产出具有更高生物活性或独特性质的蛋白质。蛋白质工程的主要步骤通常包括：（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。高等植物细胞培养高等植物细胞具有全能性。从高等植物的幼胚、根、茎、叶、花和果实等不同器官的组织中分离的单个细胞，经过特殊培养形成愈伤组织，并可进一步诱导生成完整的植株。高等植物细胞培养动物细胞培养细胞重构技术细胞重组是把不同种类的细胞的部件重新组合装配。细胞融合是将不同种类的两种细胞经过特殊处理后放在一起，在某些促融因子作用下发生融合，形成杂种细胞。原生质体融合现代发酵工程主要指利用利用微生物、动植物细胞和基因工程菌在在人工生物反应器（发酵罐）中培养而获得产物的工业过程。现代发酵工程是生物代谢、微生物生长动力学、大型发酵罐或生物反应器研制、化工原理等密切结合和应用的结果。

发酵工程离子交换的应用蒸发和结晶技术的应用过滤膜技术色层分离技术应用生物技术的基本内容（几大领域）：基因工程：用“剪刀+糨糊”创造新物种的工程。细胞工程：微观水平的嫁接技术酶工程：让工厂高效、安静、美丽如画的工程。发酵工程：把微生物或细胞造就成无数微型工厂，将神话变为现实的桥梁。蛋白质工程：巧夺天工的技术。第二节发酵工程概述一.什么叫发酵二．发酵工程的发展史三.发酵工业的特点四.发酵工业的范围

一、发酵的定义（fermentation)1、传统发酵2、生化和生理学意义的发酵3、工业上的发酵1、传统发酵

fervere”

发泡最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。2、生化和生理学意义的发酵指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。3、工业上的发酵

利用微生物、植物、动物，在合适的条件下，经特定的代谢途径转变成所需产物的过程。包括：1.厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。2.通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。发酵的分类

1.

按获取能量的方式分——好氧发酵，厌氧发酵2.

按产物类型分——初级代谢物发酵，次级代谢物发酵；食品发酵，有机酸发酵，氨基酸发酵，维生素发酵，抗生素发酵……3.

按操作类型分——自然发酵，纯种发酵，混种发酵；分批发酵，半连续发酵，连续发酵；固态发酵，液态发酵4.按发酵生物类型分——细菌发酵，真菌发酵，基因工程菌发酵，动植物细胞发酵

SOLID-STATEFERMENTATIONPRODUCTION二．发酵工程的发展史

1．发酵现象的发现与利用2.小生命体的发现3.发酵本质的阐明4.纯粹培养技术的开发5.发酵中酶催化反应的发现6.大规模液体沉没发酵技术的开发7.现代生物技术的应用

三、发酵工业的特点优点1.产物结构复杂性和特异性：手性或光学活性2.过程安全性：水相、常温、常压、中性、不燃不爆3.主要原料可再生性：阳光和土地4.原料可替换性5.反应自控性6.设备通用性7.副产物可综合利用性8.生产能力可提高性：突变与基因扩赠9.产物类型可塑性：突变与转基因缺点1.副产物多，分离精制困难2.反应速度慢3.原料转化率低4.反应浓度低5.生产稳定性差6.设备庞大，辅助设备多，投资大7.废水、废渣排放量大，处理费用高8.生产过程容易受到其他微生物的污染9.通气、搅拌、冷却等能耗大四、发酵工业的范围1．发酵食品工业(FermentedFoods)

：酱油，食醋，豆瓣酱，酸菜，活性酵母，活性乳酸菌，面包，酸奶，奶酪，酱豆腐，纳豆、白酒，黄酒，米酒，葡萄酒，啤酒，果酒。2．有机酸发酵工业OrganicAcids

：醋酸，乳酸，柠檬酸，葡萄糖酸，苹果酸，衣康酸，琥珀酸，丙酮酸，反丁烯二酸等。3．氨基酸发酵工业AminoAcids

：谷氨酸，赖氨酸，色氨酸，苏氨酸，精氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸等。

四、发酵工业的范围4．低聚糖与多糖发酵工业oligosaccharidesandpolysaccharides：低聚果糖，香菇多糖，云芝多糖，葡聚糖，黄原胶等。5．核苷酸发酵工业Nucleotides

：肌苷酸（IMP），鸟苷酸（GMP），黄苷酸（XMP）。6．药物发酵工业Pharmaceutical：抗生素:青霉素，头孢菌素，链霉素，红霉素，四环素，制霉菌素，丝裂霉素等。基因工程制药工业：促红细胞生成素（EPO），集落刺激因子（CSF），表皮生长因子（EGF），人生长激素，干扰素，白介素，各种疫苗，单克隆抗体等。药理活性物质发酵工业：免疫抑制剂，免疫激活剂，糖苷酶抑制剂，脂酶抑制剂，类固醇激素等四、发酵工业的范围四、发酵工业的范围7．维生素发酵工业vitamin：维生素C，维生素B2，维生素B12等。8．酶制剂发酵工业Enzymes

：淀粉酶、蛋白酶、脂酶、青霉素酰化酶、葡萄糖氧化酶、海因酶等。9.发酵饲料工业Feedstuff

：干酵母、单细胞蛋白、酵素菌、益生菌、青贮饲料、抗生素和维生素饲料添加剂等。10生物肥料与农药工业：

biofertilizerandbiologicalpesticide细菌肥料、赤霉素、除草菌素、苏云金杆菌、白僵菌、绿僵菌、杀稻瘟菌素、有效霉素、春日霉素等。11.溶剂发酵工业：Solvent酒精、甘油、乙醇、丙酮、丁醇溶剂等。12..水的生物处理工业及环保：EnvironmentalApplication(WasteTreatment)活性污泥、沼气发酵、有毒物质降解等。

四、发酵工业的范围WTO带来的机遇和挑战发酵工业的产业特点：1、技术中等复杂而又相对成熟（不属于高端技术）2、劳动中等密集、资源消耗较大，污染大。

所以从国际产业分工格局的趋势看，理应由发达国家转移到优秀的发展中国家来。而中国是发展最快的发展中国家，有很好的产业基础和人力资源，进入WTO之后，中国可以更直接地参与国际产业分工，所以应当成为世界发酵第一大国和第一强国。

WTO带来的机遇和挑战发酵产业在我省区域经济中是最具特色的，石家庄是全国发酵工业的中心，是医药原料抗生素、维生素的生产基地。“药都”的提出意味着石家庄市可能成为中国发酵产业的第一大市和第一强市。天时和地利都已齐备。菌种筛选摇瓶试验发酵罐中试由实验室研究到产业化的过程发酵生产发酵工程的基本技术过程Theessentialcomponentsofafermentor发酵的主体设备发酵工程生产产品的流程图《发酵工程工艺原理》课程的内容绪论培养基生产菌种的选育灭菌与无菌空气的制备生产菌种的制备发酵动力学发酵工艺过程控制染菌的防治主要参考书：

《发酵工艺原理》中国医药科技出版社《新编生物工艺学》华东化工大学出版社《生物化学工程》上海科学技术出版社《微生物工程工艺原理》华南理工大学出版社《现代生物技术概论》北京师范大学出版社《微生物工程》科学出版社

《发酵工业概论》中国轻工业出版社

主要专业期刊微生物学报微生物学通报食品与发酵工业工业微生物生物工程学报生物工程进展食品与生物技术生物技术通报医药生物技术

专业站点生物引擎：美国化学网数据库群：

/databases美国国立医学图书馆Pubmed数据库/PubMed中国生物工程网：生物桥：生物论坛：中国发明专利技术信息网：

欧洲专利条约组织：

中国数字图书馆：5/一、发酵过程检测控制的主要的参数

1、物理参数检测参数检测方法

单位

影响温度铂电阻

热敏电阻

℃

μqPc*罐压(0.20.5×105Pa)隔膜传感器压敏电阻Pa保持正压，防止染菌O2及CO2

的溶解度搅拌转数频率计数器

r/minKla发酵液的均匀性

搅拌功率(2-4KW/m3)功率计KwKla空气流量浮子流量计

孔板差压计

m3

h-1vvmKla粘度旋转粘度计

Pa

sKla浊度浊度计%反映单细胞的生长

料液的流量蠕动泵

荷重传感器量筒L

h-1

S发酵过程检测控制的主要的参数

2、化学参数检测参数检测方法

单位

影响及作用PH复合玻璃电极

菌体和产物合成速度酶促反应的方向基质浓度产物浓度HPLC离子选择电极生物传感器取样g

L-1

μqP发酵周期的长短氧化还原电位氧化还原电位电极mV生长和生化活性溶氧浓度覆膜氧电极

%qo2气相O2含量

顺磁氧分析仪

Pa反映OUR和Kla气相CO2含量

红外气体分析仪

%反映OUR和Kla发酵过程检测控制的主要的参数

3、生物参数检测参数检测方法

单位

影响菌丝形态摄像显微镜取样镜检

反映菌体发育阶段和正常与否菌体浓度取样：干重、浊度、活菌计数、离心沉降g

L-1

影响菌体的生化反应KlaμqPqSqo2(OUR)CER(Co2释放速率)RQ(呼吸商:CER/OUR)YxsYps

Kla等

发酵过程检测控制的主要的参数

4、间接状态参数二、控制方式

一般检控系统包括3个部分。

1．测定元件：如温度计、压力表、电流计、pH计直接测定发酵过程的各种参数，并输出相应信号。

2．控制部分：其功能主要是将测定元件测出的各种参数信号与预先确定值进行比较，并且输出信号指令执行元件进行调整控制。3．执行元件：它接受控制部分的指令开启、或关闭有关阀门、泵、开关等调节控制机构，使有关参数达到预定位置。手动控制和自动控制发酵控制FermentationControl

SampleAnalysispHDOSugarAmmoniaPhosphateSulphateProductsPrecursorsContaminationPressureprobeLevelprobepHprobeTemp.probeDOprobeAntifoamAcid/BaseCoolingAir/agitationSugar/OilfeedPenicillinFermentationProfile变化曲线第一节温度的影响及控制一、温度对发酵的影响：影响各种酶促反应的速度酶活温度发酵温度升高，生长代谢加快，生产期提前。发酵温度太高，菌体容易衰老，发酵周期缩短。改变发酵液的物理性质：温度影响基质和氧的吸收速度影响饱和溶氧浓度改变菌体代谢产物的合成方向例：温度小于30℃，合成金霉素的能力强温度等于35℃，只合成四环素二、影响发酵温度变化的因素：

发酵热（KJ/m3h）发酵热=生物热+搅拌热-蒸发热-显热-辐射热生物热：产生菌在生长繁殖过程中，释放的大量热量。影响生物热的因素：与菌种遗传特性有关与菌龄有关：对数生长期生物热最大。与营养基质有关与产量有关搅拌热：由于搅拌器的转动引起液体的摩擦产生的热量。蒸发热：发酵液蒸发水分带走的热量。搅拌热=P3600/V显热：发酵排气散发带走的热量。辐射热：由于罐内外的温差，辐射带走的热量。三、最适发酵温度的选择选择既适合菌体生长又适合代谢产物合成的温度可实行变温控制：在生长阶段选择适合菌体生长的温度，在产物合成阶段，选择适合代谢产物合成的温度。确定最适发酵温度还应参考其它发酵条件：在较差通气条件下，降低发酵温度对发酵有利培养基成分较易被利用或较稀薄时，降低发酵温度有利四、发酵温度的控制在发酵罐上安装夹套和蛇罐，通过循环冷却水控制。冷却介质：深井水或冷冻水控制方式：手动控制或自动控制温度计温度控制器调节阀第二节pH的影响及控制一、pH对发酵的影响：影响菌体生长代谢的酶活性影响代谢产物的合成方向影响菌体原生质膜电荷的改变，引起膜对离子的渗透作用，影响了营养物的吸收和代谢产物的分泌。pHGrowth2-3pHunitspH的变化决定于所用的生产菌：培养基中营养物质的代谢引起pH的变化：培养基pH在发酵过程中能被菌体代谢所改变。若阴离子氮源被利用后产生NH3

，则pH上升；有机酸的积累，使pH下降。一般来说，高碳源培养基倾向于向酸性pH转移，高氮源培养基倾向于向碱性pH转移，这都跟碳氮比直接有关。生理酸性物质和生理碱性物质的消耗二、影响发酵pH变化的因素：根据不同菌种的生理特性，确定不同的最适pH同一菌种根据不同阶段，生长期采用最适生长的pH，在产物采用最适产物合成的pH。三、最适pH的选择四、pH的控制采用合适的培养基配比C：N合适生理酸性物质和生理碱性物质比例合适添加缓冲物质：碳酸钙和磷酸盐在发酵过程中直接补加酸或碱过去流加硫酸或氢氧化钠，现采用补加氨水、尿素、硫酸铵在发酵过程中调节补糖速度控制pH几种具体情况的调节方法当pH低，氨基氮含量低时当pH高，氨基氮含量低时当pH高，氨基氮含量高时当pH由于多加了削沫剂而下降时pH的控制系统pH电极设定控制器调节阀6.5pHUncontrolledControlled经消毒的pH电极装入发酵罐内定时直接测定培养基的pH，同时还可以与控制仪表连结，通过回路系统控制阀门或泵进行pH调节。菌体浓度的增加速度（生长速度）与微生物的种类和自身的遗传特性有关第三节菌体生长速度和菌体浓度的影响及控制影响菌体浓度的因素菌体浓度的增加速度（生长速度）与营养基质的种类和浓度有关（μ正比于S）当存在基质抑制作用时或造成高渗透压时，高浓度营养基质引起生长速率下降。菌体浓度的增加速度（生长速度）受环境条件的影响最适菌体浓度的确定优化控制的目标：在最短的时间内产生最大量的产物。(dP/dtMAX)dP/dt

=qPXqP=f〔X，μ，qO2

qSCL〕以青霉素发酵为例qP/qPmμ

/μm1.0-1.0青霉素发酵的qP与μ的关系μCμ＞μCqP可维持在qPmaxμ＜μCqP随μ减小而减小要保证生产菌获得最大的比生产速率，就必须维持较大的比生长速率。但是，过高的比生长速率造成过高的菌体浓度，造成不利影响：过高的比生长速率和过高的菌体浓度造成的不利影响：1、μ过高，S消耗过快，有限的营养基质只能用于生长，而不足于产物合成。2、有毒中间产物的快速积累，会改变菌体的代谢途径，抑制产物合成。3、X过高，增加OUR，且发酵液粘度增大，减小OTR。CL减小，抑制菌体生长和产物合成。最适X？最适μ为等于或稍大于μC青霉素发酵的qP、OUR、OTR与X的关系1.0-X

/Xm1.0OURqP/qPmOTRdp/dtXCOUR=OTR时的菌体浓度为最适菌体浓度，

在发酵过程中，控制目标为保持稳定的临界菌体浓度和临界比生长速率，以维持呼吸临界溶氧浓度为前提的耗氧速率与供氧速率的平衡，从而使产物合成速率和比速率达到最大值。

生长速度和菌体浓度的控制方法确定基础培养基的适当配比，防止培养基过于丰富或过于稀薄。通过调节中间补料的速度和量来控制。第四节营养基质的影响及控制

一、碳源种类：葡萄糖优点：吸收快，利用快，能迅速参加代谢合成菌体和产生能量缺点：有些品种产生分解产物阻遏效应。一）、碳源种类的影响及控制迅速利用的碳源缓慢利用的碳源种类：淀粉、乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油优点：不易产生分解产物阻遏效应。有利于延长次级代谢产物的分泌期缺点：溶解度低，发酵液粘度大。

发酵工业中常采用含迅速利用的碳源和缓慢利用的碳源的混合碳源。迅速利用的碳源满足菌体生长的消耗，缓慢利用的碳源，满足产物合成，可延长合成期，提高产量，并可解除葡萄糖效应。碳源种类的控制二）、碳源浓度的影响S过小μ＜μCqP随μ减小而减小S过大μ＞＞μCX＞＞XCOUR增大CL＜CLCqP减小粘度增大Kla减小产生分解产物阻遏作用的碳源浓度过大，会抑制产物合成。三）、碳源浓度的控制在发酵过程中，补加糖类控制碳源浓度补料的类型：1、流加2、少量多次的加入3、多量少次的加入残糖量pH值QcX粘度溶氧尾气中O2和CO2的含量发酵液的总体积补糖的依据：根据经验，以最高产量的罐批的加糖率为指标，并依据菌体浓度、一定时间内的糖比消耗速率和残糖等加以修正。例：青霉素发酵开始补糖在残糖降至1.5%,pH开始回升时补糖。补糖量以最高罐批经验量为参考。每小时前期0—40h中期40—90h后期90以后加糖量0.08%-0.15%0.15%-0.18%0.15%-0.18%补糖量的控制：

经验法：补糖量的控制：

动力学方法依据μ、qP、qC等动力学参数

之间的关系，计算加糖量以次级代谢产物为例：μ、qP、qC之间的关系：X

μqpqCS控制原则：以维持临界生长限制基质浓度、临界菌体浓度和临界比生长速率为指标的基质流加速率与消耗速率的平衡。具体方法：1、求X0测定XOTROURXXCOUROTRX02、求μ、qp在发酵过程中，测定每小时菌体干重X和产物P计算每小时μ、qpμ=△X/△tXqp=△P/△tX3、确定适宜的μ—μ0qPμμC确定μ0等于或稍大于μC可使qP达到qPmax4、确定适宜的qC

qC0=m+μ0/Yxs+qPmax/Yps5、根据物料平衡计算加糖速率每小时加糖量=qC0X0v–发酵液的残糖量补料液的含糖量qC=m+μ/Yxs+qP/Yps补糖的控制把计算的加糖量，输入计算机，由计算机控制加料装置精确控制加入的糖量。二、氮源的影响和控制

一）氮源的种类影响种类：氨水、铵盐和玉米浆优点：易被菌体利用，明显促进菌体生长缺点：对于有些品种高浓度的铵离子抑制产物合成迅速利用的氮源缓慢利用的氮源种类：黄豆饼粉、花生饼粉、和棉子饼粉优点：利用缓慢，有利于延长次级代谢产物的分泌期。防止早衰。缺点：溶解度低，发酵液粘度大。

发酵工业中常采用含迅速利用的氮源和缓慢利用的氮源的混合氮源。迅速利用的氮源促进菌体生长繁殖，缓慢利用的碳源，满足产物合成，可延长合成期，延缓自溶期。二）氮源种类的控制三）氮源浓度的影响控制补氮的依据：残氮量、pH值、菌体量氮源浓度对菌体生长和产物合成的量与方向都有影响。氮源浓度的控制：控制基础培养基中的配比。通过补加氮源。补氮量的控制：经验法：依据使pH升高0.1而通入氨水的量来计算。依据残氮量和工艺控制残氮量来计算。例：土霉素发酵50m3发酵罐使pH升高0.1通氨量为10升。使氨基氮上升0.004%-0.005%。动力学方法；通过qN、μ、qP，计算每小时的补氮量。磷酸盐能明显促进产生菌的生长。（0.32-300mM）对于次级代谢产物，高浓度的磷酸盐能抑制产物合成。（10mM以下）三、磷酸盐的影响和控制

一）磷酸盐源的影响二）磷酸盐浓度的控制一般在基础培养基中采用适宜浓度。对于初级代谢产物，磷酸盐浓度采用足量。对于次级代谢产物，磷酸盐浓度采用生长亚适量。一般磷酸盐采用单消，防止发生沉淀反应使溶磷量达不到最适量。要控制有机氮源中的磷含量，以防溶磷量超过最适量。当菌体生长缓慢时，可适当补加适量的磷，促进菌体生长。一、泡沫对发酵的影响泡沫的持久存在影响着微生物对氧的吸收，妨碍二氧化碳的排除，因而破坏其生理代谢的正常进行，不利于发酵；使发酵液的装料系数减少。由于泡沫大量生成，致使培养液的容量一般只能等于种子罐容量的一半左右，大大影响了设备的利用率。大量的泡沫易造成逃液。增加污染杂菌的机会。造成巨大损失。第五节泡沫的影响及其控制二、泡沫的控制方法减少培养基中易起泡的成分减少培养基中粘度大的成分适当减少通气量及搅拌转速采用机械消泡（罐内装置和罐外装置）采用削沫剂消泡工业上常用的消泡剂天然油脂类

玉米油、豆油、棉籽油、鱼油等高碳醇类

十八醇、乙二醇聚合物聚醚类

聚氧丙烯甘油、聚氧乙烯丙烯甘油硅酮类

聚二甲基硅氧烷泡沫的检测和控制最简单的检测是定时在发酵罐视孔上观察泡沫产生情况，发现泡沫持续上升时，开启消泡剂贮罐的阀门，流加少量消泡剂，使泡沫消失即可。也可在罐内顶部装液位仪与控制仪表连结，用以控制消泡贮率阀门的开启。当泡沫上升接触探头顶端时产生的信号，通过控制装置，指令打开泵开关或阀门，自动加入消泡剂，泡沫消失，信号也随之消失，阀门关闭。消泡剂使用的注意事项：不能用量过大细密地扩散到泡沫效果好加入土温-80具有增效作用多种消泡剂并用

溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为控制因素。

在28℃氧在发酵液中的100％的空气饱和浓度只有0.25mmol.L-1左右，比糖的溶解度小7000倍。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100％空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中溶氧可在几分钟之内便耗竭，使溶氧成为限制因素。第六节氧的供需及对发酵的影响第一节微生物对氧的需求一、描述微生物需氧的物理量比耗氧速度或呼吸强度（QO2）：单位时间内单位体积重量的细胞所消耗的氧气，mmolO2·g菌-1·h-1

摄氧率(r)：单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。mmolO2·L-1·h-1

。r=QO2.X二、溶解氧浓度对菌体生长和产物形成的影响CCrQO2CLCCr:

临界溶氧浓度,指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。一般对于微生物：CCr:

＝1～15%饱和浓度例：酵母4.6*10-3mmol.L-1,1.8%

产黄青霉2.2*10-2mmol.L-1,8.8%定义：氧饱和度＝发酵液中氧的浓度/临界溶氧溶度所以对于微生物生长，只要控制发酵过程中氧饱和度>1.问题：一般微生物的临界溶氧浓度很小，是不是发酵过程中氧很容易满足。例：以微生物的摄氧率0.052mmolO2·L-1·S-1

计，

0.25/0.052=4.8秒注意：由于产物的形成和菌体最适的生长条件，常常不一样：

头孢菌素卷须霉素生长5%(相对于饱和浓度）13%产物>13%>8%三、影响需氧的因素r=QO2.X

菌体浓度QO2

遗传因素

菌龄

营养的成分与浓度

有害物质的积累

培养条件第二节反应器中氧的传递一、发酵液中氧的传递方程CCiPPi气膜液膜N：传氧速率kmol/m2.hkg:气膜传质系数kmol/m2.h.atmKl:液膜传质系数m/hC*＝P/H,与气相中氧分压相平衡的液体中氧的浓度Kl:以氧浓度为推动力的总传递系数(m/h)再令：单位体积的液体中所具有的氧的传递面积为a(m2/m3)Nv：体积传氧速率kmol/m3.hKla:以(C*-C)为推动力的体积溶氧系数h-1二、发酵液中氧的平衡发酵液中供氧和需氧始终处于一个动态的平衡中传递：消耗：r=QO2.X氧的平衡最终反映在发酵液中氧的浓度上面三、供氧的调节C有一定的工艺要求，所以可以通过Kla和C*来调节其中C*＝P/HNvHPKla第六章氧的供需及对发酵的影响调节Kla是最常用的方法，kla反映了设备的供氧能力，一般来讲大罐比小罐要好。

45升1吨10吨搅拌速度250rpm120120供氧速率7.610.720.1第三节影响Kla的因素

Kla反映了设备的供氧能力，发酵常用的设备为摇瓶与发酵罐。一、影响摇瓶kla的因素为装液量和摇瓶机的种类摇瓶机往复，频率80-120分/次，振幅8cm旋转，偏心距25、12,转述250rpm装液量，一般取1/10左右：

250ml15-25ml500ml30ml750ml80ml例：

500ml摇瓶中生产蛋白酶，考察装液量对酶活的影响装液量30ml60ml90ml120ml

酶活力71373425392二、影响发酵罐中Kla的因素已知在通风发酵罐中，全挡板条件下：Kla=K[(P/V)α(vs)β(ηapp)-w]P/V—

单位体积发酵液实际消耗的功率（指通气条件下）。（KW/m3

）Vs—

空气的直线速度（m/h），截面积一定，反映的空气的体积流量（m3/h)（vvmm3/m3min)ηapp—发酵液的粘度（kgs/m2)α、β、w—指数，与搅拌器和空气分布器的形式有关K—经验常数1、理论上分析KLand通气量提高搅拌，调节kla的效果显著例某一产品的发酵

dnp0/vc产量

4501801.6220%49784502802.1240%55645501802.6160%8455例黑曲霉生产糖化酶

n230230270

通气比1:0.81:1.21:0.8

产量181224162846提高d、n显著提高C,提高了产量提高N,比提高Q有效2、实际上：对于转速的调节有时是有限度的通风的增加也是有限的蒸发量大中间挥发性代谢产物带走例：红曲霉生产色素用于食品工业，静止培养改为通气培养，比色法测定产量：通气静止1.42.03.16.819.5OD0.280.78.315.614.36.2提高下降所以这些因素的存在，发酵设备的供养是有限的3、小型发酵罐和大型发酵罐调节kla的特点

小型发酵罐，转速可调

大型发酵罐，转速往往不可调

大型反应器的合理设计

对现有设备一定要注意工艺配套4、影响Kla的其它因素空气分布器液体的粘度传质介质溶氧浓度的变化及其控制一、典型的分批发酵中氧浓度的变化规律（一定Kla下）：rXQCL一般有一个低谷，在对数生长的末期二、发酵过程中溶氧的控制1、溶氧控制的策略微生物反应:

XS→P+Xπ=a+bμ菌体生长期：酶系统Ⅰ酶系统Ⅱ关键因子开始的细胞生长好后的细胞产物合成产物形成期：底物产物酶系统Ⅱ

反应动力学问题

发酵过程的控制一般策略：前期有利于菌体生长，中后期有利用产物的合成溶氧控制的一般策略：前期大于临溶氧浓度，中后期满足产物的形成。2、溶氧控制的实例GAXDO谷氨酸发酵：要求：氧饱和度>1控制：0-12小时小通风

12小时后增加通风原因：0-12小时菌体量较小，采用小通风12

一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。但是通气增大的时间一定要把握好。例：生产肌苷酸：通气量不变17.15mg/ml24小时增加22.55mg/ml30小时增加18.25mg/ml36小时增加12.34mg/ml例：某厂青霉素发酵的工艺研究*三、发酵过程中溶氧浓度监控的意义1、考察工艺控制是否满足要求2、其它异常情况的表征染菌、噬菌体、设备和操作故障3、间接控制的措施第一节微生物的特性及工业微生物的要求一、微生物的特性

有些微生物能在厌氧的条件下生长

有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身的生长

有些微生物能进行复杂的代谢

有些微生物能利用较复杂的化合物

有些微生物能在极端的环境下生长二：工业化菌种的要求

能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物

有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强

遗传性能要相对稳定

不易感染它种微生物或噬菌体

产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）

生产特性要符合工艺要求放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源一、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：第二节已工业化产品生产菌的介绍二、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50,60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：HD:高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制

HT:高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌三、食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌三、常用的基因表达系统(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌沙门氏菌

生长迅速、蛋白产量高;

表达蛋白的纯化、分离及分析快速；

外源基因的导入相对容易；

已建立了整套表达理论及技术.(二)真核细胞表达系统

酵母(既是微生物又是真核细胞)

生长迅速，营养要求不高，易培养；

安全性好；

比哺乳动物细胞操作简单；

具有一定的修饰蛋白的能力。

中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统

具有准确的转录后修饰功能；

具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；

具有重组基因的高效扩增和表达能力；

具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；

CHO很少分泌自身的内源蛋白。微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？礼来(Elililly),花了10年的时间从40万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。例：第三节自然界中有目的微生物分离的原则一、菌种分离的一般过程土样的采取→预处理→培养→菌落的选择→产品的鉴定如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物问题：二、采样时要注意的问题

气候、水分、空气

来源要广

结合产品的特点

标签：地点、时间、气候等富集的三种方案：

定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养。三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。

当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分类学中考虑，

不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这时只能通过随机分离的办法定向培养的方法物理方法：加热、膜过滤等，表2-2（P31）但主要是通过培养的方法定向培养的富集方法1、底物2、pH条件3、培养时间4、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。四、菌落的选出

从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（P35）

从形态的角度

菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）采样（造纸厂）→80度30分钟处理文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落从285个土样中获得62株26株为组成型36株为诱导型↓例：醛肟水解酶的筛选

--Journalofbiotechnology94(2002),65-72培养基中含0.05%ofZ-PAOx

每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落五、目的微生物富集方法的研究进展

分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等

目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。

2002,陈文新（科学院院士）

Incontrasttothistraditionalapproach,modernmolecularbiologytechniquesallowforDNAlibraryexpressionscreening,whichalsoenablesaccesstoenzymesof`nonculturable'organisms.Bythisstrategy,forinstance,thecompanyDiversa(SanDiego,CA,USA)identised120uniqueesterases/lipasesfromonly16%ofthetotalDNAobtainedfromanalkalinesoilsample.FEMSMicrobiologyReviews26(2002)73～81第四节菌株选育、分子改造目的

提高生产能力

提高产品质量

开发新产品

解决生产实际问题

防止菌种退化方法基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易错PCR、同序法DNAShuffling等自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9自然突变有两种情况：一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。一、自然选育自然选育在工业生产上的意义自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞(孢子)悬液的制备平板分离挑选单菌落(注意形态的观察)发酵试验二、诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂物理在：紫外，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍{（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题

化学诱变剂使用过程的安全性诱变剂量的选择诱变剂的选择出发菌株的选择（一）、诱变剂的作用原理（略）压硝酸：0.07MNa2HPO4亚硝基胍：1MNaOH（三）、诱变育种的一般步骤(p83)（四）、筛选的方法

随机筛选

形态

理性化筛选从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。HD:高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制

HT:高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶结构类似物抗性：Lys的类似物AEC,Thr的类似物AHV营养缺陷型：如Thr缺陷型黄色短杆菌F9-50的诱变谱系BervibacteriumflavumAs1.495(leu-)lys.HCl2.1g/lF6-16(leu-,Thr-)20.8g/lF9-50(leu-,Thr-,AECr)33.5g/l三、基因的直接进化(directedevolution)

突变基因突变库的建立筛选基因突变库的筛选基因复制与遗传步骤：

在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。主要应用：酶学性能的提高:pH

温度

有机溶剂生理环境→工业催化环境

底物专一性脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯例：PLAPLA光学拆分选择性(%)231577581905次错位PCR2次定点突变Reetz(1997)Liebeton(2000)第二章菌种的来源定点突变错位PCRDNAShuffling:指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(SexualRecombination)。XXXX

XXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXXX

XXX

XXXX

XXXX

XXX

XXXXXXXXXXXXXXXX

FragmentReassembleSelectbestwithDNAseIfragmentsrecombinantsRepeatformultiplecyclesDNAshuffling项目进化速度进化对象进化周期影响对象突变效率常规定向进化缓慢进化整个基因组多年完整基因组低DNAShuffling快速进化特定基因/操纵子/病毒几天部分基因组高DNAShuffling与常规定向进化的比较类型示例特性活性增加倍数潜在应用领域抗体人源抗体亲和性400生物制药酶天冬氨酸转氨酶催化特异性10，000生物制药β-内酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草杆菌蛋白酶E耐热性65℃耐热时间17200工业酶细胞因子人类干扰素抗病毒285，000基因治疗肿瘤抑制因子P5337℃半衰期12基因治疗代谢途径砷酸盐代谢途径砷酸盐解毒40生物制药汞代谢途径汞解毒12生物制药部分DNAShuffling技术的研究成果灭菌：指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备中所有生命物质的技术或工艺过程。

第一节灭菌的原理及方法一几种常见的灭菌方法1化学物质灭菌原理：药物与微生物细胞中的成分反应，使蛋白质变性酶失活。常用的灭菌剂:使用范围：器皿、双手和实验室、无菌室的环境灭菌，不能用于培养基灭菌

常用的灭菌剂化学物质名称有效浓度化学物质名称有效浓度新洁尔灭(苯扎溴铵)0.25%甲醛37%杜灭芬0.25%戊二醛2%高锰酸钾0.1%-0.25%苯酚0.1%-0.15%漂白粉5%过氧乙酸0.02%-0.2%酒精75%焦碳酸二乙酯0.01%-0.1%煤酚皂（来苏尔）1%—5%

*2.

辐射灭菌原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。

常用：紫外线、X射线和γ射线。

使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌

3．干热灭菌

原理：利用高温对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。常用方法：灼烧和电热箱加热，140-180℃1-2小时使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌4．湿热灭菌

原理：蒸汽冷凝放出大量潜热，具有穿透力，且在高温有水分条件下，蛋白质易变性。常用方法：水煮常压灭菌：100℃饱和蒸汽灭菌：一般121℃，30分钟使用范围：培养基和发酵设备灭菌。

5．过滤除菌

原理：利用微生物不能透过滤膜除菌。方法:0.01~0.45

m孔径滤膜，使用范围：用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。

二.湿热灭菌原理

1.生物热死动力学（对数残存定律）

dN/dt=-KN

N：菌体个数（个）

t:灭菌时间（min）k：反应速度常数（min-1）dN/dt:菌受热死亡速率(个/min)LnN/N0=-KtN=N0e-Kt以菌的残留数LnN/N0的对数与时间t作图，得出一条直线，其斜率为-K（P222图14-1）

如何通过实验根据对数残存定律确定某一温度,某一微生物的K？1).K与菌种的特性有关相同温度下，微生物越耐热，k值越小。相同温度下，微生物越不耐热，k值越大。

2.反应速率常数K

2).K与灭菌温度有关K=Ae–E

/RT（阿累尼乌斯方程）LnK=LnA-E/RTA：比例常数R：气体常数(J/molK)T：绝对温度(K)△E：杀死细菌所需的活化能（J/mol）121℃118℃115℃110℃105℃

第二节培养基和发酵设备的灭菌工艺

一．培养基灭菌时间的选择t=1/k*Ln(N0/N)

其中K：一般耐热的细菌芽孢的K值

N0：细菌及芽孢数之和

N：10-3二.培养基灭菌温度的选择

选择即能达到灭菌要求，

又保证营养成分不被破坏的温度1.培养基营养成分破坏动力学方程-dC/dt=K’C-dC/dt:营养物降解速度mol/LhC:营养物浓度mol/LK’:

营养物降解反应速度常数1/st：时间(S)Ln(C/C0)=-K'tK’=

A’e-E’/RT

LnK’=LnA’-E’/RTA’：比例常数R：气体常数(J/molK)T：绝对温度(K)E’：营养物破坏所需的活化能（J/mol）2.根据实验结果灭菌活化能大于培养基破坏活化能E＞E’P225表14-113.灭菌反应

营养物破坏反应

T1 LnK1=LnA-E/RT1 LnK1’=LnA’-E’/RT1T2LnK2=LnA-E/RT2 LnK2’=LnA’-E’/RT2Ln(K2/K1)=E/R(1/T1-1/T2)Ln(K2’/K1’)=E’/R(1/T1-1/T2)Ln(K2/K1)=ELn(K2’/K1’)E’Ln(K2/K1)＞Ln(K2’/K1’)K2/K1＞K2’/K1’

当温度升高时微生物死亡速度常数比营养物质降解速度常数变化得大4．达到相同灭菌效果，T越高，K越大，所需t越短，采用高温短时（HTST）灭菌效果好

三影响灭菌效果的因素微生物种类：不同的微生物k值不同。初始菌量：在保持N值不变的前提下，t与初始菌量N0的对数成正比。培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐热性。传热与混合状况：影响受热均匀度。培养基中固体颗粒的存在影响热穿透。蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度。pH：酸性pH下可加快微生物热死速率

四.培养基和发酵设备的灭菌方法

（一）实验室种子培养基灭菌方法使用高压蒸汽灭菌锅

手提式灭菌锅。容量小。立式或卧式灭菌锅。容量较大，一般能装几十瓶或几百瓶。灭菌柜。要和蒸汽锅炉配套，用于大量种瓶培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶(袋)。四.培养基和发酵设备的灭菌方法

（二）分批灭菌(batchsterilization)1．定义：将配制好的培养基输入发酵罐中，用蒸汽加热，使培养基和设备同时灭菌的一种灭菌方式。2．操作过程：空罐准备：清洗、检修和检测。升温：把培养基加热到灭菌所需的温度。保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间。冷却保压：把培养基的温度降低到接种的温度。温度随灭菌时间的变化三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。这就是所谓的“三路进气”。

*四路出汽：直接蒸汽从排气、接种、进料和消沫剂管排气分批灭菌设备示意图

三）连续灭菌(continuoussterilization)1．定义：将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续流动灭菌后，进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌方式。

2．流程：

1)由热交换器组成的灭菌系统

2)蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统

3）由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统

由热交换器组成的灭菌系统工艺流程图温度随时间的变化蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统温度随灭菌时间的变化由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统三）连续灭菌与分批灭菌的比较与选择分批灭菌优点：1．不需附加设备2．

蒸汽利用率高3．

节约劳动力

缺点1．

培养基质量比较差2．

罐的利用率低3.冷却水用量大连续灭菌优点：1采用高温快速灭菌法2．可以把培养基按其性质分开灭菌3．有利于自动控制4．节省冷却水缺点1．

投资费用高2．

对物料要求高3．

蒸汽用量大选择原则：

1．

培养基成份（易降解成分、液化情况等）

2．

设备状况（冷却面积、传动装置等）

3.动力条件四、高温对培养基成分的有害影响及其防止

消除高温有害影响的措施（1）采用特殊加热灭菌法(连续灭菌方法）（2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；（3）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；（4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌

第三节空气除菌一、无菌空气的要求1.空气中的微生物空气中的微生物种类以细菌和细菌芽孢较多，也有酵母，霉菌孢子和病毒。这些微生物大小不一，一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为103~104个／米3。灰尘粒子的平均大小约0.6μm左右，所以空气除菌主要是去除空气中的微粒(0.6-1μm）第三节空气除菌一、无菌空气的要求无菌空气的标准百分数：99.99％美国联邦宇航局等级标准：100级（直径小于0.5微米粒子数少于3.5个/L）温度：25℃—40℃湿度：30%—45%

1.

纤维或颗粒介质填充床过滤器：棉花、玻璃纤维、腈纶、涤纶、维尼纶或活性炭等

2.折叠式硼硅酸超细纤维过滤器：超细玻璃纤维

3.烧结金属、陶瓷过滤器

二介质除菌：原理：过滤介质填充到过滤器中，空气流过时借助惯性碰撞、阻截、扩散、静电吸附、沉降等作用将尘埃微生物截留在介质中，达到除菌的目的。主要设备：填充床过滤器发酵生产中制备无菌空气的大致过程

空气介质除菌流程高空取气管是远离地面几十米的管子。一般而言，地面附近空气中所含的微生物和灰尘等均比高空空气中含的多，据资料介绍，每升高10米，空气中杂菌可降低一个数量级，因此从高空取气要比从低空取气有利得多。两级分离、冷却、加热的空气除菌流程

１——粗过滤器２——压缩机３——贮罐４——冷却器

５——丝网分离器６——过滤器

高效前置过滤除菌流程

１——高效前置过滤器２——压缩机３——贮罐４——冷却器

５——丝网分离器６——加热器７——过滤器

第一节染菌的检查与判断

一、杂菌污染的检查

培养基（1）细菌培养基营养肉汤：glucose10g,peptone5g,beefextract5g,NaCl5g,distilledwater1000ml,pH7.2~7.4。酚红肉汤：营养肉汤+1%phenolred3ml。营养琼脂：glucose5g,peptone10g,beefextract3g,NaCl5g,agar15~20g,distilledwater1000ml,pH7.2~7.4。2）酵母培养基

萨氏培养基（Sabouraud’sagar）：glucose40g,peptone10g,agar15~20g,distilledwater1000ml,pH5.6。（3）霉菌培养基察氏培养基（Czapek’sagar）：sucrose30g,NaNO33g,K2HPO41g,MgSO4

7H2O0.5g,KCl0.5g,agar15~20g,distilledwater1000ml,pH6.6。无菌检查的流程：取样接入试管或斜面培养（细菌32~37℃，1~2天；真菌25~28℃，1~3天）肉眼检查镜检二、通过异常现象判断溶解氧水平异常变化显示染菌发酵时间溶氧浓度正常发酵污染噬菌体发酵时间溶氧浓度正常发酵污染好气性杂菌污染非好气性杂菌排气中CO2异常变化显示染菌二、通过异常现象判断工艺一定，尾气中CO2量变化有一定规律污染杂菌，糖耗加快，尾气中CO2量增加污染噬菌体，糖耗减慢，尾气中CO2量减少种子系统空气带菌设备渗漏培养基灭菌不彻底操作失误第二节染菌原因的分析

从染菌规模分析大规模染菌空气净化系统种子染菌、接种管道渗漏部分罐批染菌某一批号种子染菌某一套连消系统染菌补料管路渗漏或补料液带菌个别罐批连批染菌设备问题个别罐不连批染菌培养基灭菌不彻底或操作失误早期染菌培养基灭菌不彻底种子带菌接种管道灭菌不彻底或接种操作不当中期染菌培养基灭菌不彻底加消沫剂、补料系统灭菌不彻底或渗漏发酵设备渗漏泡沫顶罐后期染菌空气系统有问题从染菌时间分析酵母菌：种子室、摇瓶间、计量罐、进料补料阀门、搅拌轴封、被倒流的空气介质霉菌：种子室、摇瓶间、搅拌轴封、被倒流的空气介质、空气普通杆菌：空气过滤介质、冷水设备渗漏、设备死角渗漏芽孢杆菌：培养基灭菌不彻底、设备有死角球菌：空气系统、无菌间摇瓶间空气中从染菌的菌型分析第三节染菌的防治措施

一、一般染菌的防治预防种子带菌：

环境清洁，无菌操作设备完好、可靠，无菌操作用品灭菌彻底，操作熟练，制度严格。一、一般染菌的防治消灭培养基染菌：

严格物料采购、运输、仓贮配料（防止块状物料、清洗配料罐）灭菌（保证蒸汽的压力、稳定及畅通、按操作规程操作）保压（防治培养基倒流）

严防空气带菌：提高空气进口的洁净度除尽压缩空气中的油和水空气过滤器灭菌时防止被冲翻保证空气过滤器介质的填装质量一、一般染菌的防治杜绝设备污染：良好的设计（无死角）规范的安装彻底的清洗严密的维修有效的灭菌。一、一般染菌的防治染菌罐的处理种子罐染菌灭菌后放下水道并对种子罐、管道进行检查和灭菌启用备用罐或倒种

发酵灌染菌前期：危害大的灭菌后放下水道危害不大，可重新灭菌，重新接种中后期：降低培养温度，降低通风提前放罐控制补料量染菌罐的处理二、噬菌体污染的防治

噬菌体污染的鉴别

现象鉴别：发酵液变稀、发粘，OUR

，DO

，NH4+—N

，泡沫

。平板鉴别：观察噬菌斑。污染的预防

选育抗噬菌体菌株；

环境、明沟、下水道定期消毒；

排气过滤，菌体排放前灭菌；

选用孔径为0.01

m的微滤膜空气过滤器；

发酵车间远离农田、排污明渠、污水处

培养基中加入适量化学消毒剂：三聚磷酸钠0.2%~0.3%，植酸0.1%~0.2%，柠檬酸0.2%~0.5%，草酸0.2%~0.5%，新洁而灭0.02%~0.05。

生产菌种的必备条件：1生长快：2对环境条件要有比较大的承受能力3遗传表现型要稳定，不易退化4菌种要纯斜面沙土管冷干管液氮管实验室种子制备生产现场种子制备生产种子制备的一般流程

二级斜面一级斜面米孢子母瓶

子瓶一级种子罐发酵罐

二级种子罐三级种子罐菌种保藏几个概念种子罐级数：种子在种子罐中需扩大培养的次数。发酵级数：种子罐的级数加一。接种量：放罐的种子罐的培养液体积除以接种后培养液的体积的百分数。种龄：生产种子的培养时间。一斜面种子的制备

1.斜面种子：在试管或扁瓶内，以琼脂固化的培养基表面上生长的菌种培养物。2.制备流程：3.制备过程注意事项

(1)

琼脂要完全浸没在营养液内,用量1.0%-2.5%(2)营养液中最好不含易沉淀的固形物；

(3)装量掌握在斜面顶端不超过试管或扁平长度