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文档简介

PCR扩增出靶基因的时候在核（一）（二）两个位点应是载体上的，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往造成两个promega的阐明书上说，最佳隔四个。尚有一种状况是：不能有碱基的交叉，例如两个酶切点最佳不要是同尾酶（切下来的残基不要互补最佳使用双酶切有共同buffer最佳使用较惯用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等TmTmTmDNADNATmTmTm（除非你的酶切位点也与模板互补Tm过低，是由于他们误把保护碱TmPCR反映的诸多困难。因此，设计引5'Tm55度以上（58以Tm护碱基，这样的引物普通都是可用的，即使有小的问题，也能够挽回。Tm温度高的引物就33'2+4的公式。Tm90，不涉及酶切位点。引物公司给你发的单子是涉及酶切位点29、33个碱基，去17、2170多度，实际用的只5055度扩的成果也差不多。其它有关Tm值的计算，PP5.0进行评价的，需要考虑的参数涉及：basenumberGC%、Tm、hairpin、dimer、falsepriming、crossdimer。退普通退火温度为Tm-5度，退火，Tm的话,2.有人的经验加入酶切位点的引物能够和未加入时使用相有关引物二聚体primer或是其它设计引物的软件进行计算一下另外，所加的三个核苷酸的保护序列通过尽心设计有时也能够减少二聚体的△G20bp28bp左右了。而我们在设)PCR产物连接到载体。53AT。先用软件设计出适宜的引物，引物的应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A（容易错配）引物3’端最佳碱基的选择是最少隔上3个碱基，PCR产物很难被酶切，因此就会造成连接5‘5‘端加5其3（NEB网站1B采用了一系列含识别序列（这里用的是寡核苷酸！！而不是末端带酶切位点的肽链！（例如在多接头上切割位点很靠近时ANEB就提供了一种表，有关链长和切割效otI10259％的效率，204个碱基，也没见出现问题。2将线性载体与对应内切酶（10units/µg）60分钟，随即进（EcoRI酶切位点NNNGNNC3PCR4个额NotI7100(2)BluescriptSK-Spe4100(1)BluescriptSK-Ksp198(2)BluescriptSKXba 酶切割率220Not00NsiPac0000Pme0000Pst0000Pvu000SacSac00Sal00GScaSma00Spe00Sph000StuXba00Xho00Xma00酶切割率220Acc000000Afl00AscAvaBamHBgl00BssH0000BstE0Bst

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