濒危野生植物及其制品物种鉴定规范

1濒危野生植物及其制品物种鉴定规范本标准规定了濒危野生动物及其产品物种鉴定时物种鉴定的一般原则、物种鉴定指标、仪器设备和试剂要求、实验室环境要求、人员资质要求、鉴定程序、方法确认、档案管理、污染预防与处理、安全防护、国际国内合作与援助、持续能力提升等主要技术内容。本标准适用于濒危野生动物及其产品物种的鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GA/T382-2014法庭科学DNA实验室规范NY/T541动物疫病实验室检验采样方法SN/T4495-2016检验检疫实验室危险品管理规范LY/T2501-2015野生动物及其产品的物种鉴定规范GB/T27401-2008实验室质量控制规范动物检疫3术语及定义3.1濒危野生动物endangeredwildlife濒危野生动物是指所有由于物种自身的原因或受到人类活动或自然灾害的影响，而有灭绝危险的野生动物物种。从广义上讲，濒危动物泛指珍贵、濒危或稀有的野生动物。从野生动物管理学角度讲，濒危动物是指《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录所列动物，以及国家和地方重点保护的野生动物。。3．2濒危野生动物产品endangeredwildlifeproducts前款所指濒危野生动物的任何部分及其已全部或部分加工的衍生物。3.3物种鉴定speciesIdentification采用形态学、生物化学、分子生物学等检验技术，对野生动物及其产品进行分类地位（科、属、种）的认定。3.4检材checkmaterials&checksamples委托单位（人）提供的、用作物种鉴定的野生动物及其产品。3.5形态鉴定法Morphologicalidentification对动物的形态特征采用观察、测量、比较、核对、分析等手段。3.6显微镜镜检法Microscopicexamination从显微结构或亚显微形态对检材进行区分鉴定。3.7理化检验法Physicalandchemical根据不同种动物各部分组织组成成份的物理化学性质存在差异进行检验。3.8蛋白质分析法Proteinanalysis分析蛋白质携带信息的异同以确定不同的物种。3.9免疫学鉴定法Immunologicalidentification根据物种存在种属特异性抗体和抗原，相互作用以鉴定物种的手段。3.10分子生物学方法Molecularbiologicalmethods运用现代分子生物学技术鉴定野生动物检材。4缩略语4.1DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸。4.2RNAribonucleicacid核糖核酸。4.3cDNAcomplementaryDNA逆转录后与RNA互补的DNA链。4.4mtDNAMitochondrialDNA，Mitochondrialdeoxyribonucleicacid线粒体脱氧核糖核酸。4.5DNasedeoxyribonuclease3脱氧核糖核酸酶。4.6FluorescentquantitativePCR，qPCR荧光定量聚合酶链式反应。4.7RFLPrestrictionfragmentlengthpolymorphism限制性片段长度多态性。5种鉴定的一般原则5.1根据不同检材特性进行初步判断，缩小目标物种范围，选择准确鉴定方法。5.2对宏观不易看清的或肉眼不能看到的微观结构特征的检材，可通过显微镜镜检法以鉴定物种种5.3对各部分组织成份理化性质存在差异的检材，可通过理化检验法以鉴定物种种属。5.4形态学方法无法认定，但能够提取DNA的样品，可采用分子生物学方法进行鉴定。5.5形态学方法中具有唯一性的特征指标可以单独使用，如指标特征不具有唯一性，则应联合使用多个以上指标进行鉴定。5.6如果一种分子生物学方法不能可靠地确认样品为物种时，应使用2种或以上方法进行联合印证。5.7必要时，可形态学方法和理化方法及分子生物学方法结合使用。6物种鉴定指标6.1宏观形态学指标以物种典型或特异的形态特征作为鉴定指标，具体鉴定指标参见濒危动物鉴定相关标准和LY/T2501-2015等相关标准和技术文件。6.2微观形态学指标根据兽毛、羽毛、牙齿、角、蹄、喙等组织的典型或特异性的微观形态学指标。6.3生物化学指标以物种典型或特异的生化特征、在阴性和阳性严格对照下作为鉴定指标。6.4分子生物学指标以物种DNA长度多态性和序列多态性作为分子生物学指标。应经过有效性验证。7实验室环境要求7.1实验室基本要求7.1.1实验室应设立完善的组织、质量保障和管理体系。7.1.2实验室的各功能分区应布局合理，通风良好、光线适度、设备完善、达到鉴定的要求。7.1.3配备生物安全设施，确保人员不受野生动物疫病的侵害。47.2实验室区域设置原则7.2.1实验室区域设置的一般原则区域设置应符合鉴定实验流程，避免实验过程中检材和试剂受到污染，确保鉴定结果准确可靠。7.2.2基本区域设置（1）宏观形态学鉴定、微观形态学鉴定、生物化学鉴定、免疫学鉴定和分子生物学鉴定应分别设置鉴定区域。（2）微观形态学鉴定室和生物化学鉴定室应分别设置样品制备和鉴定两个基本区域。（3）分子生物学鉴定实验室应分区，包括样品处理室、核酸提取室、PCR反应体系配制室（区）、加样室（区）、核酸扩增室、产物分析室、数据分析室。7.2.3其他区域设置（1）接样室主要用于检材的受理，包括登记、检材的初检和照相、录像、固定等，以及来客的接待。（2）样品贮存室主要用于送检材料和参考样品的妥善保管和贮存。（3）试剂贮存和配制室主要用于试剂的贮存、配制等。（4）数据分析室主要用于鉴定结果的分析、比对、鉴定报告的形成等。（5）档案室主要用于鉴定资料、质量体系文件、实验操作相关资料的存档保存等。8仪器设备和试剂要求8.1设备8.1.1实验室应设立完善的组织机构、质量保障和管理体系。8.1.2实验室的各功能分区应布局合理，通风良好、光线适度、设备完善，达到检验鉴定的要求。8.1.3配备生物安全设施，确保人员不受野生动物疾病的侵害。8.1.4仪器设备基本配置要求。（1）形态学鉴定实验室设备配置体视显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、放大镜、电锯、电钻、手提紫外光灯、LED手电、照相机、防护眼镜、防护面罩、破拆工具、切割工具、打磨工具、不同量程的称量工具和测量工具等。（2）生物化学鉴定实验室设备配置气象色谱仪、液相色谱仪、恒温水浴箱、酸度计、电热干燥箱、生化培养箱、恒温磁力搅拌器、超声波清洗机、可见光分光光度计、紫外可见分光光度计、低温离心机、通风橱、组织匀浆机、电子天平、分析天平等。5（3）免疫学鉴定实验室设备配置酶标仪、酶标板恒温振荡器、自动洗板机、微量振荡器、数显恒温水箱、微量移液器、超纯水器、高压灭菌锅、（4）分子生物学鉴定实验室设备配置遗传分析仪、冷冻研磨仪、PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪、凝胶分析成像系统、天平、冷冻离心机、水浴锅、微量加样器（不同规格的）、超低温冰箱、冰柜、超纯水器、高压灭菌锅、漩涡振荡器、微量核酸定量仪、生物安全柜、超净台以及相关的专业分析软件等。8.1.5鉴定方法所必需的关键（核心）设备所产生的数据或结果应能够被同行认可。8.1.6仪器设备应定期进行检查、保养和校准。8.1.7新购置的仪器设备、或原有仪器设备维修保养后，在使用前应当进行校准和测试。8.2实验耗材和试剂8.2.1实验室应配置与其所应用的鉴定方法所必需的实验耗材和试剂。8.2.2所有实验耗材和试剂应处于保质期或有效期内。8.2.3商品试剂盒应标明有效期，试剂盒的使用应有记录。8.2.4实验室自行配制的试剂应在容器上标明名称、浓度、配制时间、配制人、保存条件、失效日期等相关内容。8.2.5每一批次购进的耗材和试剂应进行质控检验。9人员资质要求9.1工作人员包括鉴定人和鉴定助理等应遵守国家有关法律法规，诚实守信，有良好的职业道德操守，严格遵守海关相关规定和要求，严格保守秘密。9.2技术负责人应具备博士学位或具有副高级以上专业技术职称，相关专业，五年以上相关工作经验，具备形态学和分子生物学相关专业背景和熟练操作技能，了解濒危动物物证鉴定领域的前沿技术。9.3鉴定人应具备中级以上专业技术职称，相关专业，在相关实验室工作一年以上，并通过能力验证或实验室间比对等测试。9.4鉴定助理应具备本科以上学历，相关专业，具有6个月以上相关技术培训的经历。9.5必要时，技术负责人和鉴定人按照有关要求有配合相关部门履行结果解释和出庭义务。10鉴定程序10.1检材受理（1）鉴定实验室应具备配合有关部门进行现场取样的能力，现场取样技术要求参照相关指南。6（2）建立样品接收、取样、使用、保存、样品处置相关流程和记录。（3）样品受理应由专门人员负责。样品受理人负责验明送样方身份证明材料有效性，对检材来源、状态和数目、包装、鉴定目的和要求等进行审核，并根据情况与对方签订相关鉴定受理书。（4）样品受理人应要求送检人填写送检登记表，详细填写送检单位、送检人姓名、送检日期、检材类型、数量及特征、鉴定要求等基本情况，并对送检人、检材以及检材的交接等进行拍照或录像存档。（5）需提取实物样品以备复核鉴定的，应告知送检人。（6）需对检材进行破坏性取样而严重改变其原有价值的，应征得送检单位同意。（7）对于明显超出鉴定范围和鉴定能力的鉴定要求以及不适于鉴定或无法鉴定的检材，实验室不予受理。对于在鉴定过程中可能出现难以得出明确结论等情况，样品受理人应明确告知对方，并在与送检方签订鉴定受理书时写入告知或免责声明之中。（8）检材应按要求形成唯一的报检号，送入鉴定实验室后应由专人管理，并按待检、在检和已检分开存放；样品交接和使用的经手人应签名留痕。10.2鉴定原则本着由简单到复杂、由无损到有损的原则确定鉴定方法。每项鉴定应由两位鉴定人完成。10.3样品鉴定。10.3.1宏观形态学鉴定法对动物的形态特征采用观察、测量、比较、核对、分析等手段，根据动物特有形态特征，对濒危动物活体或者比较完整尸体、毛皮或骨骼以及具有很特殊性状的检材，根据物种鉴定指标为依据作出鉴定。物种鉴定指标参见LY/T2501-2015等有关标准和技术文件为依据进行鉴定。10.3.2微观形态学鉴定法借助仪器设备将宏观不易看清的或肉眼不能看到的微观形态展现出来，从显微结构或亚显微形态对检材进行鉴定，偏光显微镜、荧光显微镜、紫外光显微镜、电子显微镜以及显微摄影技术等可用于物种微观性状的观察，显微图片应标注放大倍数。毛发是显微镜镜检鉴定技术的一类重要检材。10.3.3生物化学鉴定法根据不同物种特定成份分析即采用理化分析方法确定检材中特定的某种或某几种成份的差异以区分检材，达到鉴定动物种属的目的。主要包括特定成份分析和广谱成份分析两种。10.3.4蛋白质分析法不同的物种，其蛋白质、酶组成、结构和序列存在差异，对样本的蛋白质进行分析，根据蛋白质携带信息的异同可确定不同的物种。10.3.5免疫学鉴定法根据物种存在种属特异性抗体和抗原，用已知的种属特异性抗血清检测未知检材的种属来源，为动物物证的种属作出鉴定，可用于对血痕、组织碎屑等用形态学无法辨认的检材。710.3.6分子生物学方法DNA提取根据鉴定目标选择的检验方案确定DNA提取的方法，应设置空白对照并严格防止样品相互污染。需要纯化的DNA，可选择高质量纯化试剂盒或其他纯化方法。PCR扩增严格设置阳性(已知的DNA样品)和阴性(不加DNA的空白)对照。检验时样本要在分子量标准之间的泳道上电泳。荧光定量PCR扩增可用Taq-Man探针和SYBRGreenI荧光染料方法，严格设置阳性和阴性对照。PCR-RFLP分析通过PCR扩增一段DNA片段，再选择适当的限制性内切酶消化PCR产物，电泳分析特异性谱带，对物种间和物种内遗传多样性、不同基因型作出鉴定。测序对线粒体DNA（mtDNA）和细胞色素b（cytb）进行测序分析，鉴定动物检材的种属；通过短串联重复序列遗传多态性分析进行个体识别和亲子关系鉴定。10.4检材的保存和处理10.4.1实验室鉴定完成后，按照实验要求备份检材样品，备份检材份量至少应保证2次复检所需用量，剩余部分应返还委托单位或经得委托方同意后作销毁处理。10.4.2备份和待检的检材应按照要求进行保存和保管，应配备专门的保管负责人员，做好保存记录和登记，保障检材的性质不受到损坏和变质。10.4.3备份和待检检材若有丢失，应立即向上级主管部门报告，造成严重后果的，应寻求公安机关的协助。10.4.4确诊存在疫病的检材，应立即进行无害化处理。鉴定完成无误后，备份超过保存时间的检材，应进行无害化处理。10.5结果分析实验室依科学方法对实验数据进行分析和论证，并经两位鉴定人签字确认。能够明确给出认定或否定结论的，形成鉴定意见。10.6鉴定的复核对鉴定结果不明确或其他特殊需要，按有关程序经同意可送相关权威机构进行复核鉴定。10.7鉴定质量控制（1）对鉴定过程中出现结果明显偏离和错误，鉴定人应立即报告技术负责人，并停止鉴定工作。技术8负责人应与鉴定人一起对影响鉴定的各个环节（包括样品、仪器、试剂、分析方法、实验环境和污染等）逐一排查，确定问题来源，并整改。整改应有记录，并存档。（2）对影响鉴定结果的关键设备和试剂，实验室除定期进行校准、验证和维护外，还应进行期间核查。期间核查应有计划，并记录存档。（3）实验室应制定计划组织内部评审、质量评审、管理评审、参加能力验证和实验室间比对等，以确保对鉴定质量的有效控制。评审过程和评审发现的问题应形成评审报告，并存档。10.8鉴定报告起草形成明确鉴定结论的，起草鉴定报告。报告应有一定的格式（可参照有关标准）。鉴定人对鉴定结果负责，须在鉴定报告书上签名。10.9鉴定报告的审核、签发技术负责人负责鉴定报告内容的审核，实验室负责人负责鉴定报告的签发。最后，鉴定报告加盖公章后生效。11方法确认11.1标准方法确认（1）根据检材的需要和实验室的实际情况优先选择使用标准方法。（2）实验室在采用标准方法之前，应对实验室能否正确执行该标准方法进行确认。具体确认要求按GB/T27025-2008《检测和校准实验室能力的通用要求》执行。（3）如实验室采用的标准方法发生了改变，实验室应重新进行确认。11.2非标方法确认非标方法包括海关总署下发的技术文件、其他实验室采用、权威刊物发表和实验室自行研制的尚未形成标准的鉴定方法。非标方法应符合GB/T27401-2008《实验室质量控制规范动物检疫》要求。实验室在没有标准方法或现有标准方法无法完成鉴定的情况下可考虑采用非标方法，但必须经过如下验证确认。（1）其他实验室采用、权威刊物发表非标方法须经至少6家实验室联合验证确认。（2）实验室自行研制的鉴定方法须经同行专家组成的专家组审核，并经至少6家实验室联合验证确认。12档案管理档案包括以下各方面的资料。12.1鉴定档案资料9包括受理记录、送检单位的相关证明材料、检材照片、检材保管或返回记录、检材交接记录等。12.1.2鉴定数据资料包括记录不同鉴定过程及鉴定实验所产生各种实验原始数据资料。如各种量度和称量数据、生化鉴定实验记录、DNA提取、定量记录、PCR反应记录、电泳检测记录、测序结果、数据分析结果等。12.1.3图谱图片资料包括扫描电镜照片、光镜照片、仪器分析图表、照片、自显影图、干燥胶等。12.1.4鉴定报告资料包括鉴定报告、检验结果图谱等，以及鉴定报告审核和签发记录。12.2操作手册12.2.1实验方法类兽毛鳞片压模片、髓质花纹片的制备方法及程序，扫描电镜样品的制备方法及程序，特殊成分的生化检验方法，各种DNA提取方法、DNA定量方法、DNA测序和片段分析方法以及各种物种鉴定方法及程序等。12.2.2仪器操作类各种仪器的操作使用手册、维护方法等。12.2.3试剂配制类各种试剂的配制方法、贮存方法等。12.3说明书类重要仪器设备说明书、试剂盒使用说明书、特殊试剂说明书等。12.4方法确认记录鉴定方法等的确认程序、专家会议纪要、确认过程记录等。12.5管理档案包括实验室质量控制、实验室管理、安全操作、人员档案、人员培训、实验室核查、资格测试、实验室运行记录（包括主要仪器设备的使用记录、保修和维修记录、突发事件处理记录等）等。12.6其他资料物种鉴定工作流程图、仪器设备清单、储存试剂的清单等。12.7电子化管理对鉴定报告、备份样品名录等建立的数据库进行电子化管理。12.8保密凡鉴定报告应在指定地点由专人负责保管，未经主管领导书面同意不能复制、外借，更不可遗失。主管领导签发的复制和外借凭证等应与鉴定报告一起存档保存。13污染预防与处理13.1检材样品