微生物酶制剂生产工艺及其在食品工业中的应用

微生物酶制剂消费工艺及其在食品工业中的运用冯华炜目录微生物酶制剂的简介微生物酶制剂的消费技术微生物酶制剂在食品工业中的运用一、简介1、定义酶制剂是指从生物中提取的具有酶特性的一类物质，酶制剂主要作用是催化食品加工过程中各种化学反响，改良食品加工方法。是一类从动物、植物、微生物中提取具有生物催化才干的蛋白质。微生物酶制剂就是从微生物中提取的蛋白质。

2、微生物酶消费开展概略1894年，日本科学家初次从米曲霉中提炼出淀粉酶，并将淀粉酶用作治疗消化不良的药物，从而开创了人类有目的地消费和运用酶制剂的先例。1911年，美国科学家从木瓜中提取出木瓜蛋白酶，并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊物。以后，酶制剂的消费和运用就逐渐开展起1949年，科学家胜利地用液体深层发酵法消费出了细菌α－淀粉酶，从此揭开了近代酶工业的序幕。1971年，第一次国际酶工程学术会议在美国召开，会议的主题就是固定化酶的研制和运用。20世纪70年代后期，酶工程领域又出现了固定化细胞技术。1986年，我国科学家利用固定化原生质体发酵消费碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相继获得胜利，为酶工程的进一步开展开辟了新的途径。近20年来，随着基因工程的渗入，使酶的定向改呵斥为能够，所以在固定化酶、固定化细胞和固定化原生质体开展的同时，酶分子修饰技术、酶的化学合成以及酶的人工合成等方面的研讨，也在积极地开展中，从而使酶工程更加显示出宽广而诱人的前景。3、利用微生物提取酶制剂的意义及其优点酶是一种生物催化剂，催化效率高、反响条件温暖和专注性强等特点，曾经日益遭到人们的注重，运用也越来越广泛。生物界中已发现有多种生物酶，在消费中广泛运用的仅有淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、脂肪酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶等十几种。利用微生物消费生物酶制剂要比从植物瓜果、种子、动物组织中获得更容易。由于动、植物来源有限，且受季节、气候和地域的限制，而微生物不仅不受这些要素的影响，而且种类繁多、生长速度快、加工提纯容易、加工本钱相对比较低，充分显示了微生物消费酶制剂的优越性。利用微生物产酶的优点是：(1)微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。(2)微生物生长繁衍快，易提取酶，特别是胞外酶。(3)微生物培育基来源广泛、价钱廉价。(4)可以采用微电脑等新技术，控制酶发酵消费过程，消费可延续化、自动化，经济效益高。(5)可以利用以基因工程为主的现代分子生物学技术，选育菌种、添加酶产率和开发新酶种。二、微生物酶的消费技术二级种子一级种子三角瓶种子斜面菌种培育基灭菌接种固体发酵液体发酵空气紧缩过滤浓缩酶液枯燥酶粉提取酶液图1.微生物酶制剂的消费工艺〔一〕、产酶微生物消费酶制剂的微生物有丝状真菌、酵母、细菌3大类群，主要是用好气菌。几种主要工业酶的菌种和运用情况如下：淀粉酶类、蛋白酶、葡糖异构酶、其他重要工业用酶〔二〕、酶的消费方法酶的消费是指经过预先设计，并且经过人工控制而获得所需求的酶的过程。概括地说，酶的消费方法有提取法、发酵法和化学合成法三种。提取法是最早采用并且不断沿用至今的一种方法。它采用各种技术，直接从动植物或微生物的细胞或组织中将酶提取出来。提取法虽简单易行，但必需求有充足的原资料，这就使提取法的广泛运用遭到了限制。发酵法是20世纪50年代以来消费酶的主要方法。它主要经过微生物发酵来获得人们所需求的酶。发酵法普通包括固体发酵、液体深层发酵、固定化细胞发酵和原生质体发酵等多种方式。化学合成法是20世纪60年代末出现的一种消费酶的新技术，目前依然停留在实验室内合成的阶段。1.菌种选择微生物发酵消费酶的方法同其他发酵行业类似，首先必需选择适宜的产酶菌株，然后采用适当的培育基和培育方式进展发酵，使微生物生长繁衍并合成大量所需的酶，最后将酶分别纯化制成一定的酶制剂。〔三〕、微生物酶制剂消费任何生物都能在一定的条件下合成某些酶。但并不是一切的细胞都能用于酶的发酵消费。普通说来，能用于酶发酵消费的细胞必需具备如下几个条件：酶的产量高优良的产酶细胞首先具有高产的特性，才有较好的开发运用价值。高产细胞可以经过挑选、诱变、或采用基因工程、细胞工程等技术而获得；容易培育和管理，要求产酶细胞容易生长繁衍，并且顺应性较强，易于控制，便于管理。产酶稳定性好在通常的消费条件下，可以稳定地用于消费，不易退化。一旦细胞退化，要经过复壮处置，使其恢复产酶性能。利于酶的分别纯化发酵完成后，需经分别纯化过程，才干得到所需的酶，这就要求产酶细胞本身及其它杂质易于和酶分别。平安可靠要运用的细胞及其代谢物平安无毒，不会影响消费人员和环境，也不会对酶的运用产生其它不良的影响。2、产酶培育酶的发酵消费是以获得大量所需的酶为目的。为此，除了选择性能优良的产酶细胞以外，还必需满足细胞生长、繁衍和发酵产酶的各种工艺条件，并要根据发酵过程的变化进展优化控制。1)

固体培育法

固体培育是以麸皮或米糠为主要原料，另外添加谷糠、豆饼等为辅助原料。经过对原料发酵前处置，在一定的培育条件下微生物进展生长繁衍代谢产酶。固体培育法比液体培育法产酶量高。同时还具有原料简单、不易污染、操作简便、酶提取容易、节省能源等优点。缺陷是不便自动化和延续化作业，占地多、劳动强度大、消费周期长。

2)液体培育法液体培育法的优点是：占地少、消费量大、适宜机械化作业、发酵条件容易控制、不易污染，还可大大减轻劳动强度。其培育方法有分批培育、流加培育和延续培育三种，其中前两种培育法广为运用，后者因污染和变异等关键性技术问题尚未处理，运用遭到限制。3)

产酶条件的控制

〔1〕培育基培育基的营养成分是微生物发酵产酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是无机盐、生长因子和产酶促进剂等。①碳源碳素是构成菌体成分的主要元素，也是细胞贮藏物质和消费各种代谢产物的骨架，还是菌体生命活动的能量的主要来源。当前酶制剂消费上运用的菌种大都是只能利用有机碳的异养型微生物。有机碳的主要来源有：一是农副产品中如甘薯、麸皮、玉米、米糠等淀粉质原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉质原料。不同的细胞对各种碳源的利用差别很大，所以在配制培育基时应根据不同细胞的不同要求而选择适宜的碳源。另外，选择碳源除思索营养要求外，还要思索酶生物合成的诱导作用和能否存在分解代谢物阻遏作用。尽量选器具有诱导作用的碳源，尽量不用或少用有分解代谢物阻遏作用的碳源。例如，α－淀粉酶的发酵消费中，应该选用有诱导作用的淀粉作为碳源，而不用对该酶有分解代谢物阻遏作用的果糖作为碳源。②氮源氮是生物体内各种含氮物质，如氨基酸、蛋白质、核苷酸、核酸等的组成成分。酶制剂消费中的氮源主要有有机氮源和无机氮源两种，常用的有机氮源有：豆饼、花生饼、菜籽饼、鱼粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；无机氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3P04、尿素等。不同的细胞对各种氮源的要求各不一样，应根据要求进展选择和配制。普通来说，动物细胞要求有机氮，植物细胞主要要求无机氮。多数情况下将有机氮源和无机氮源配合运用才干获得较好的效果。例如黑曲霉酸性蛋白酶消费，只用铵盐或硝酸盐为氮源时，酶产量仅为有胨时的30%。只用有机氮源而不用无机氮源时产量也低，故普通除运用高浓度有机氮源外尚需添加1%~3%的无机氮源。③碳氮比在微生物酶消费培育基中碳源与氮源的比例是随消费的酶类、消费菌株的性质和培育阶段的不同而改动的。普通蛋白酶(包括酸性、中性和碱性蛋白酶)消费采用碳氮比低的培育基比较有利，例如黑曲霉3.350酸性蛋白酶消费采用由豆饼粉3.75%、玉米粉0.625%、鱼粉0.625%。NH4Cl1%、CaCl20.5%、Na2HP040.2%、豆饼石灰水解液10%组成的培育基；淀粉酶(包括α－淀粉酶、糖化酶、β－淀粉酶等)消费的碳氮比普通比蛋白酶消费略高，例如枯草杆菌TUD127α－淀粉酶消费采用由豆饼粉4%、玉米粉8%、Na2HP040.8%、(NH4)2SO40.4%、CaCl20.2%组成的培育基。而在淀粉酶消费中糖化酶消费培育基的碳氮比是最高的。以上是蛋白酶和淀粉酶消费培育基碳氮比的普通规律，但是由于菌种很多而其性质各异。很难说都是符合上述规律的。在微生物酶消费过程中，培育基的碳氮比也因培育过程不同而异。例如种子培育时，为了顺应菌体生长繁衍的需求，要求提供合成细胞蛋白质的氮多些，容易利用的氮源的比例大些，种子培育基的碳氮比普通要比发酵培育基低些。发酵时，不同发酵阶段要求的碳氮比也是不同的。例如在枯草杆菌BF－7658消费α－淀粉酶的发酵过程中，发酵前期要求培育基的碳氮比适当降低，以利菌体生长繁衍，发酵中后期要求培育基的碳氮比适当提高，以促进淀粉酶的生成。④无机盐微生物酶消费和其他微生物产品消费一样，培育基中需求有磷酸盐及硫、钾、钠、钙、镁等元素存在。在酶消费中常以磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等磷酸盐作为磷源，以硫酸镁为硫源和镁源。钙离子对淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种酶的活性有非常重要的稳定作用，例如在无Ca2+存在时灰色链霉菌中性蛋白酶只在pH7-7.5很小范围内稳定，当有Ca2+存在时稳定pH范围可以扩展到5-7。钠离子有控制细胞浸透压使酶产量添加的作用，酶消费的培育基中有时以磷酸氢二钠及硝酸钠等方式参与，例如米曲霉α－淀粉酶消费，添加适量的硝酸钠以促进酶消费。在天然培育基中，普通微量元素不用另外参与，但也有一些例外。如玉米粉、豆粉为碳源时，添加100ppmCo2+和Zn2+，放线菌166蛋白酶活力可添加70%-80%。⑤生长因子微生物还需一些微量的像维生素一类的物质，才干正常生长发育，这类物质统称生长因子(或生长素)。其中包括某些氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶等。酶制剂消费中所需的生长因子，大多是由天然原料提供，如玉米浆、麦芽汁、豆芽汁、酵母膏、麸皮、米糠等。玉米浆中普通含有生长素32-128mg/mL。⑥产酶促进剂产酶促进剂是指在培育基中添加某种少量物质，能显著提高酶的产率，这类物质称为产酶促进剂。产酶促进剂大体上分为两种：一是诱导物，二是外表活性剂。外表活性剂，如吐温－80的浓度为0.1%时能添加许多酶的产量。外表活性剂能添加细胞的通透性，处在气－液界面改善了氧的传送速度，还可以维护酶的活性。消费上常采用非离子型外表活性剂，如聚乙二醇、聚乙烯醇衍生物、植酸类、焦糖、羧甲基纤维素、苯乙醇等。离子型的外表活性剂对微生物有害。用于食品、医药的酶的消费中所用的外表活性剂还须对人、畜无害。此外各种产酶促进剂的效果还遭到菌种，种龄、培育基组成的影响。酶的发酵消费中发酵效果除了遭到菌种产酶性能的影响外，还遭到发酵温度、pH、溶氧量等条件的影响。(2)培育条件发酵温度发酵温度的变化主要随着微生物代谢反响、发酵中通风、搅拌速度的变化而变化的。微生物在生长发育中，不断地吸收培育基营养成分来合成菌体的细胞物质和酶时的生化反响都是吸热反响；培育基中的营养物质被大量分解时的生化反响都是放热反响。发酵初期合成反响吸收的热量大于分解反响放出的热量，发酵液需求升温。当菌体繁衍旺盛时，情况那么相反，发酵液温度就自行上升，加上通风搅拌所带来的热量，这时，发酵液必需降温，以坚持微生物生长繁衍和产酶所需的适宜温度。微生物生长繁衍和产酶的最适温度随着菌种和酶的性质不同而异，生长繁衍和产酶的最适温度往往不一致。普通细菌为37℃，霉菌和放线菌为28-30℃，一些嗜热微生物需在40~50℃下生长繁衍，如红曲霉生长温度35-37℃，而消费糖化酶的最适温度为37-40℃。在酶消费中，为了有利于菌体生长和酶的合成，也有进展变温消费的。例如以枯草杆菌ASl.398进展中性蛋白酶消费时，培育温度必需从31℃逐渐升温至40℃，然后再降温到31℃进展培育，蛋白酶产量比不升温者高66%。据报道，酶消费的温度对酶活力的稳定性有影响，例如用嗜热芽孢杆菌进展α－淀粉酶消费时，在55℃培育所产生的酶的稳定性比35℃好。种子培育基和发酵培育基的pH直接影响酶的产量和质量。在发酵过程中，微生物不断分解和同化营养物质，同时排出代谢产物。由于这些产物都与pH有直接关系，因此发酵液pH在不断发生变化。消费上根据pH的变化情况常作为消费控制的根据。普通来说，培育基成分中碳/氮(C/N)比高，发酵液倾向于酸性，pH低；C/N低，发酵液倾向于碱性，pH高。pH的这些变化情况，经常引起细胞生长和产酶环境的变化，对产酶带来不利的影响。因此消费中常采用一些控制pH的方法，通常有：添加缓冲液维持一定的pH；调理通风量维持发酵液的氧化复原电位于一定范围；调理培育基的初始pH，坚持一定的C/N比；当发酵液pH过高时用糖或淀粉来调理，pH过低时，经过氮调理。pH对产酶的影响通风量对产酶的影响其实通风量的多少应根据培育基中的溶解氧而定。普通来说，在发酵初期，虽然幼细胞呼吸强度大，耗氧多，但由于菌体少，相对通风量可以少些；菌体生长繁衍旺盛期时，耗氧多，要求通风量大些；产酶旺盛时的通风量因菌种和酶种而异，普通需求剧烈通风；但也有例外，通风量过多反而抑制酶的生成。因此，菌种、酶种、培育时期、培育基和设备性能都能影响通风量，从而影响酶的产量。目前用于酶制剂消费的微生物都为好气性微生物，消费上普遍采用自动测定和记录溶解氧的仪表。搅拌的影响对于好气性微生物的深层发酵，除了需求通气外，还需求搅拌。搅拌有利于热交换、营养物质与菌体均匀接触，降低细胞周围的代谢产物，从而有利于新陈代谢。同时可突破空气气泡，使发酵液构成湍流，添加湍流速度，从而提高溶氧量，添加空气利用。但搅拌速度主要因菌体大小而异，由于搅拌产生剪切力，易使细胞受损。同时搅拌也带来一定机械热，易使发酵液温度发生变化。搅拌速度还与发酵液黏度有关。泡沫的影响发酵中往往产生较多的泡沫。泡沫的存在妨碍了CO2的排除，影响溶氧量，同时泡沫过多影响补料，也易使发酵液溢出罐外呵斥跑料。因此，消费上必需采用消泡措施。普通除了机械消泡外，还可利用消泡剂。消泡剂主要是一些天然的矿物油类、醇类、脂肪酸类、胺类、酰胺类、醚类、硫酸酯类、金属皂类、聚硅氧烷和聚硅酮，其中以聚甲基硅氧烷最好。我国常用聚氧丙烯甘油醚或泡敌(聚环氧丙环氧乙烷甘油醚)。理想的消泡剂，其外表相互作用力应低，而且应难溶于水，还不能影响氧的传送速率和微生物的正常代谢。湿度用固体培育基消费酶制剂时，普通前期湿度低些，培育后期湿度大些，有利于产酶。3、分别提纯微生物酶的提取方法，因酶的结合形状与稳定性的不同，运用部门对产品的纯度要求不同，而有一定的区别。1)

盐析法盐析剂中性盐的选择：MgS04，(NH4)2S04，Na2SO4，NaH2P04是常用的盐析用中性盐。(NH4)2S04是最多用的盐析剂，这是由于它的溶解度在较低温度下也是相当高的。在无盐或稀盐溶液中，温度低，蛋白质的溶解度也低，但在高浓度盐溶液中，温度高那么蛋白质的溶解度反而低。因此普通说来盐析时不要降低温度，除非这种酶不耐热。

2)

有机溶剂沉淀法

有机溶剂沉淀蛋白质的才干随蛋白质的种类及有机溶剂的种类而不同，对曲霉淀粉酶而言，有机溶剂的沉淀才干，丙酮>异丙醇>乙醇>甲醇。这个顺序还受温度、pH、盐离子浓度所影响，不是一成不变的。3)吸附法

①

白土及活性氧化铝吸附法

白土类是以硅酸铝为主要成分的粘土，随其种类不同，能吸附酶或蛋白质的种类和数量也不同，普通在弱酸性条件下吸附酶或蛋白质，在中性或弱碱性条件下解吸。白土先用2mol/L盐酸活化。

活性氧化铝也是最常用的吸附酶或蛋白质的吸附剂之一。可以用明矶、硫酸铵等调制，加热使之活性化。酶或蛋白质普通在弱酸性条件下吸附，在弱碱性条件下解吸。②

淀粉吸附α-淀粉酶的方法

一定的酶只作用于特定的基质，这一现实阐明两者之间有一种特别的亲和力。因此用基质吸附那种对基质具有特定作用的酶，可以到达很好的效果。但作为吸附剂的基质首先必需是固相物；其次在吸附酶的过程中，这种基质不会被它所吸附而又专门能作用于它的酶所分解，或分解程度极微；第三是单位分量的基质吸附这种特定酶的才干均应该足够大。现发现生淀粉对α-淀粉酶的吸附是比较接近于上述条件的。4.酶制剂化和稳定化处置浓缩的酶液可制成液体或固体酶制剂。酶制剂的出卖是以一定体积或分量的酶活计价，所以消费出的酶制剂在出卖前往往需求稀释至一定的规范酶活。同时为改良和提高酶制剂的贮藏稳定性，普通都要在酶制剂中参与一种以上的物质，它们既可作酶活稳定剂，又可作抗菌剂及助滤剂，它们假设制成干粉，那么可起到填料、稀释剂和抗结块剂的作用。可用作酶活稳定剂的物质很多，如辅基、辅酶、金属离子、底物、整合剂、蛋白质等，最常用的有多元醇(如甘油、乙二醇、山梨醇、聚乙二醇等)、糖类、食盐、乙醇及有机钙。有时用一种稳定剂效果不明显，那么需求几种物质合用，如明胶对细菌淀粉酶及蛋白酶有稳定作用，但效果不明显，假设同时加人些乙醇和甘油，稳定效果就显著了四、酶制剂在食品工业中的运用酶制剂在食品保鲜方面的运用酶法保鲜技术是利用生物酶的高效的催化作用，防止或消除外界要素对食品的不良影响，从而坚持食品原有的优良质量和特性的技术。主要用于食品保鲜中的酶制剂有葡萄糖氧化酶〔Glucoseoxidase〕和溶菌酶酶制剂在淀粉类食品消费中的运用淀粉可以经过水解作用生成糊精、低聚糖、麦芽糊精和葡萄糖等产物。这些产物又可进一步转化为其他产物。在这些产物的消费中，已广泛运用各种酶。在淀粉类食品的加工中，多种酶被广泛地运用，其中主要的有a-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、支链淀粉酶、葡萄糖异构酶等。如今国内外葡萄糖的消费绝大多数是采用淀粉酶水解的方法。酶法消费葡萄糖是以淀粉为原料，先经a-淀粉酶液化成糊精，再利用糖化酶生成葡萄糖。果葡糖浆是有葡萄糖异构酶催化葡萄糖异构化生成果糖，而得到含有葡萄糖和果糖的混合糖浆。假设将异构化反响完成后，混合糖液经过脱色、精制、浓缩等过程，得到固形物含量达71%左右的果葡糖浆，其中，含果糖42%左右，含葡萄糖52%左右，另有6%左右为低聚糖。假设将异构化后的混合糖液中的果糖与葡萄糖分别，再将分别的葡萄糖进展异构化，如此反复进展，可使更多的葡萄糖转化为果糖，由此可消费出果糖含量达70%、90%甚至更高的果葡糖浆，称之为高国糖浆。，