解磷微生物研究进展

解磷微生物研讨进展郑琨苏北盐碱滩涂土壤概略解磷微生物的种类与分布解磷微生物的分别挑选解磷机制解磷才干的测定技术道路讨论一苏北盐碱滩涂土壤概略江苏沿海滩涂资源总面积约65.24×104平方公里，由潮上带(25.98×104平方公里)、潮间带(26.57×104平方公里)及辐射沙脊群的出露沙洲(12.69×104平方公里)组成。江苏海岸由砂质海岸、基岩海岸、和淤泥质海岸组成，以粉沙淤泥质海岸为主，占全省海岸线长度的90.5％江苏海岸带地势开阔，土壤类型单调，海堤以外主要分布滨海盐土类，堤内老垦区分布潮土类。潮间带的土壤为滨海盐土(海堤外至零米线的地域)，分为潮滩盐土、草甸海滨盐土和沼泽海滨盐土三个亚类。普通来说，从潮滩盐土到沼泽海滨盐土，土壤呈现含盐量逐渐降低，有机质含量逐渐升高的趋势。

开发利用沿海滩涂土壤是我国农业消费中非常迫切和重要的义务。随着耐盐作物育成和耐盐经济植物发现，这些植物的营养情况将成为今后处理的问题。盐碱土壤的另一特点是可溶性有效磷含量低，绝大部分以难溶性磷酸盐方式存在。而且盐碱土壤普通无机盐丰富，有机质严重缺乏，土壤板结，不宜施无机肥。我国每年1/3的磷肥需求进口，复合肥料和微生物肥料运用率不到30%〔兴隆国家到达50%〕。土壤中的解磷微生物，可将土壤中难溶磷酸盐转化为植物易吸收的可溶性磷，这为改善盐土植物营养情况提供了出路。二解磷微生物的种类与分布解磷微生物(Phosphate-solubilizingmicrooganism，PSM)是一类可以将植物难以吸收的磷转化为可利用形状的微生物，这类解磷微生物除了可以活化土壤中难溶性的磷外，还可以经过影响植物根系分泌物的种类和数量，以添加植物根系对周围K,Ca,Mg,Fe,Zn等营养元素的吸收，使植物可以顺应盐碱缺磷的环境。人们在20世纪初开场留意到微生物与土壤磷之间的关系。Sackett(1908)发现一些难溶性的复合物施入土壤中，可以被作为磷源而运用，他们从土壤中挑选出50株细菌，其中36株在平板上构成了肉眼可见的溶磷圈。1948年Gerretsen发现植物施入不溶性的磷肥，经接种土壤微生物后，促进了植株的生长，添加磷的吸收。他分别出了这些微生物，发现这些微生物可协助磷矿粉的溶解。从此．许多科学家努力于解磷菌的研讨，相继报道了许多微生物具有解磷作用。解磷微生物(PSM)包括细菌、真菌和放线菌。目前报道的解磷细菌主要有芽胞杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、沙雷氏菌属(Serratia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、肠细菌属(Enterbacter)、微球菌属(Micrococcus)、固氮菌属(Azotobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、色杆菌属(Chromobacterium)、产碱菌属(Alcali—genes)、节细菌属(Arthrobacter)、硫氧化硫功菌(Thiobacillusthivoxidans)和多硫杆菌属(Thiobacillus)等。解磷真菌主要是青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)和根霉属(Rhizopus)。而解磷放线菌那么绝大部分为链霉菌属(Streptomyces)。按分解底物可以将解磷微生物分为两类：一类是可以分解无机磷化合物的称为无机磷微生物(包括假单孢菌属的一些种，无色杆菌属的一些种，黄杆菌属的一些种以及氧化硫硫杆菌);一类是具有分解有机磷化合物才干的称为有机磷微生物〔包括芽孢杆菌属的一些种，变形菌属的一种，沙雷氏菌属的一些种〕。但由于解磷微生物解磷机理复杂，相当一部分的解磷既能分泌有机酸溶解无机磷盐，又能分泌磷酸酶物质分解有机磷〔包括节杆菌属的一些种、链霉菌属的一些种〕，因此很难准确区分无机磷和有机磷微生物。解磷微生物的分布表现出明显的根际效应，主要表如今：根际土壤中的数量明显高于非根际土壤。解磷菌表现出的强根际效应能够与根圈磷素营养亏缺诱导有关，但由于根圈微生物的群落构造受根系分泌物及根零落物的影响，导致不同植物根圈微生物的组成差别很大，这种作用也影响解磷菌的群落组成。同时，不同的植被类型和不同的生态环境中，土壤解磷微生物的数量，种类及菌群构造也不同。林启美(2000)等调查农田、林地、草地和菜地等4种不同土壤生态环境中解磷菌数量和种群构造时，发现前3种土壤中的有机磷细菌只需菜地土壤的1／10，但农田土壤中解磷细菌的总数所占比例并不低。耕地土壤有机解磷菌主要是芽孢杆菌属，林地和菜地那么主要是假单胞杆菌属；无机磷细菌种类比较少。三解磷微生物的分别挑选目前，分别解磷微生物的方法普通是根据在以磷酸三钙为独一磷源的平板上产生透明圈来确定。例如真菌无机磷培育基：蔗糖2g、葡萄糖2g、NH4Cl1.5g、KCl0.3g、MgSO4.7H2O0.4g、NaCl0.2g、磷酸钙20g，蒸馏水1000mL，pH7.0。假设挑选耐盐解磷菌株，那么需求根据实地盐浓度在培育基中添加NaCl。解磷微生物的挑选就是在分别出的具有解磷才干的一切菌株中挑选出具有最强解磷才干的菌株。普通来说要以该解磷微生物将要运用的实践环境作为挑选实验的条件，即在与应环境一样的温度，pH值，盐度等条件下培育解磷微生物，以解磷才干最强〔普通以培育基中有效磷含量最高为规范〕的菌株作为最优选择。四解磷机制解磷微生物溶解难溶性磷化物的机制可归结为以下几类:(1)经过生命代谢活动产生有机酸(细菌普通分泌乳酸、氨基酸、草酸、延胡索酸和柠檬酸等，真菌主要分泌草酸、丙二酸和乳酸等)，这些酸一方面直接溶解土壤中难溶性磷酸盐，另一方面那么是经过鳌协作用释放出土壤磷素。(2)由NH4+同化作用放出质子降低pH值，引起磷酸盐溶解。(3)经过呼吸作用放出C02，降低环境pH值，从而引起磷酸盐的溶解。(4)磷细菌释放H2S，与磷酸铁进展化学反响产生硫酸亚铁和可溶性磷酸盐。(5)腐解植物残体而产生胡敏酸和富里酸。这两种酸能与复合磷酸盐中的钙、铁鳌合，从而释放出磷酸根。它们也能与铁、铝及磷酸盐构成稳定的可溶性复合物，这些复合物可以被植物吸收利用。(6)微生物对钙离子的吸收，使磷酸根离子进入土壤溶液。(7)生物矿化作用。即经过分泌植酸酶、核酸酶和磷酸酶等物质，将磷酸脂等有机磷降解。五解磷才干的测定解磷才干是表征解磷微生物作用的重要目的，可采用定性法和定量法两种方法测定。定性法普通指的是平板溶磷圈法;平板溶菌圈法:将溶磷菌株在含有难溶性磷酸盐或有机磷的固体平板培育基上培育，测定周围菌落产生透明圈的大小。无机磷平板普通采用磷酸钙盐固体培育基，接种菌株培育数天后，以磷酸钙盐平板上菌落周围出现透明圈的视为有解无机磷才干的菌株。有机磷平板普通采用卵黄平板培育基，以卵黄平板上菌落周围出现混浊圈的视为有解有机磷才干(卵磷脂被水解构成脂肪和磷酸)。

溶磷圈直径〔D〕和菌落生长直径(d)的比值(D/d)是表征解磷菌相对解磷才干的一个目的。定量法包括液体培育法、土培法、砂培法和同位素示踪法。

液体培育法:将含解磷微生物和不溶性磷化物(如Ca3(P04)2)的培育液和对照(不含解磷微生物)培育一定时间后，测定培育液中可溶性磷的含量。但在液体培育法中如何将溶磷菌分解的无机磷浸提出来并加以测定，不同的研讨者采用的方法不同，总的可分为:培育液过滤法，离心取上清液法，熏蒸、消煮法等。对处置后的培育液中磷含量普通都采用钼蓝比色法测定，其原理是利用一定的酸度条件下，加钼酸铵于含磷的溶液中，溶液中的正磷酸与钼酸络合构成磷钼杂多酸。H3PO4+12H2MoO4=H3[PMo12O40]+12H2O在适宜试剂浓度下，参与适当的复原剂(如抗坏血酸)，使磷钼酸中的一部分Mo6+离子被复原为Mo5+，生成一种叫做“钼蓝〞的物质，当将含不溶性无机磷的培育液经钼磷试剂处置后，培育液发生显色反响，经过比色法间接求出培育液中水溶性磷的含量。土培(或砂培)法:普通是经过接种解磷菌株到培育植物的土壤(或砂土)中，以不接种解磷菌的植株为对照，经过测定土壤浸提液中有效磷的含量来评定解磷菌株的解磷才干。砂培法通常也结合同位素示踪法运用。同位素示踪法:在含标志有32P的不溶性磷化合物(有机磷或无机磷)的培育基内接种供试菌株，使菌体在培育过程中吸收32P，再用含32P的菌体(以含32P的不接种菌株培育基为对照)培育植物幼苗，测定该植株由标志的菌体内吸入的32P量比对照样处置的添加量，即为该菌体的解磷量。六技术道路讨论分子鉴定传统真菌菌种鉴定方法主要以形状学为根据，即经过培育后察看菌落形状和个体显微特征，将菌种鉴定到纲、门、科、属、种。然而真菌的形状特征复杂，且少数形状特征和生理生化目的随着环境的变化而不稳定，因此，在传统的真菌分类中常引起分类系统的不稳定或意见分歧。在真菌的现代分类学中引入了分子生物学技术鉴定方法，可以使菌种的鉴定在以形状特征和生理生化特征为根底的鉴定上更加准确、可靠。目前用于未知菌分类鉴定的核酸序列分析最常选用的目的片段是rDNA。真菌基因组中编码核糖体的基因包括4种，28SrDNA、5SrDNA、18SrDNA和5.8SrDNA。它们在染色体上头尾相连、串联陈列，相互之间由间隔区分隔。间隔区是位于核糖体大小亚基基因之间的核苷酸序列。位于28SrDNA的3’端与18SrDNA的5’端之间的序列称为核糖体内转录间隔区(internaltranscribedspacers，ITS)，ITS1位于18SrDNA和5．8SrDNA之间，ITS2位于5.8SrDNA和28SrDNA之间(见图1)rDNA是核基因组中的序列，遭到细胞核中维护机制的维护，同时具有多变区和保守区，利用其保守区可以研讨高级分类阶元关系，而利用多变区那么也可研讨种和种下关系。如核糖体DNA中18S，5.8S和28S的基因组序列在大多数生物中趋于保守，在生物种间变化小，而内转录间隔区ITS1和ITS2作为非编码区，接受的选择压力较小，相对变化较大，并且可以提供详尽的系统学分析所需求的可遗传性状。(技术道路)发酵条件优化发酵条件优化普通分为两步：第一步确定各个培育因子的最正确种类，第二部确定各个最正确因子的最正确程度。第一步普通采用分别确定各因子最正确种类的方法。例如，在其他培育条件一样的情况下，选用同一程度的不同碳源〔葡萄糖，蔗糖，淀粉，糖蜜，小麦麸皮等〕培育微生物，根据结果〔如菌体鲜重，解磷才干等〕选择出最正确碳源。第二步普通采用正交实验的方法。正交实验设计(Orthogonalexperimentaldesign)是研讨多要素多程度的又一种设计方法，它是根据正交性从全面实验中挑选出部分有代表性的点进展实验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比〞的特点，正交实验设计是是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。

雅致放射毛霉液体深层培育条件及发酵培育基的优化研讨〔王丽英王谦〕

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