血液制品的质量控制和安全性

血液制品的质量控制及平安性

主要内容一、血液制品的概况血液制品定义

全球血制品销售结构白蛋白类制剂主要作用；1、维持血液渗透压2、抗休克作用3、运输和解毒作用4、调节胶体渗透压紊乱而引进的机能障碍5、营养供给静脉注射人免疫球蛋白的临床应用1、特发性血小板减少性紫癜。2、原发性免疫缺陷病的替代治疗。3、继发性免疫缺陷病的替代治疗。4、川崎病。5、艾滋病的辅助治疗。6、预防成人骨髓移植的感染和移植物抗宿主病。7、其它免疫调节紊乱的适应症。

当代血液制品的主要进展我国血液制品的开展趋势国内血液制品开展国内血液制品企业及规模血液制品的相关法规-原料血浆控制-生产过程控制-病毒灭活/去除工艺艾滋病防治条例单采血浆站基本标准单采血浆站质量管理规范实施血液制品生产用原料血浆检疫期的指导原则血液制品管理条例中国药典（三部）中国药典（二部）药用辅料管理办法血液制品管理条例中国药典（三部）药品生产质量管理规范血液制品病毒灭活指导原则生物制品批签发管理办法药品经营质量管理规范药品经营质量管理规范实施细则药品流通监督管理办法原料血浆管理其他原辅料管理药品经营管理药品生产管理大体上可以分为5类:1、利用蛋白质的亲水性和疏水性即溶解度不同进行别离的方法，包括：盐析法、有机溶剂沉淀法、疏水层析法、冻融法、等电点沉淀法等。2、根据蛋白质分子大小不同，形状和密度差异进行别离的方法，包括：凝胶过滤层析法、过滤和超过滤、离心和超离心、透析法等。3、利用蛋白质带电性的别离方法：离子交换层析法、制备电泳法等。4、利用蛋白质的立体结构中的特定位点与配体的特异亲和力进行别离、纯化的亲和层析法。5、其它方法：利凡诺，聚乙二醇，硫酸铝钾等。

应多种方法组合，符合血浆综合利用的原那么。蛋白质在溶液中保持稳定根据蛋白质溶解度不同，即按蛋白质亲水性和疏水性的差异，进行别离的方法〔盐析法、等电点沉淀法〕。根据蛋白质分子大小、形状和密度差异进行别离的方法〔凝胶过滤层析法、透析法、超滤法、离心和超离心法等〕。根据蛋白质所带电性的不同进行别离〔离子交换层析法、制备电泳法等〕。根据蛋白质立体结构中的特定位点与某种特定配体的特异亲和力进行别离〔亲和层析法〕。血浆蛋白的别离制备方法：◆盐析法〔硫酸铵盐析法〕◆低温乙醇法◆离子交换层析法、亲和层析法◆利凡诺沉淀法〔已淘汰〕◆聚乙二醇沉淀法低温乙醇法五变因素◆蛋白浓度◆乙醇浓度◆温度◆pH◆离子强度五种参数加以组合，可形成许多种反响条件低温乙醇法优点◆相对简单的操作，产量高，适宜工业化规模生产。◆保持蛋白质的天然特性。◆抑菌作用。◆同时别离多种血浆成分，适于血浆综合利用。◆乙醇作为主要原材料，价格低廉，易于获得。白蛋白生产工艺(1)

混合血浆→FI+II+III上清→FIV上清→FV沉淀→精制→超滤→配制→巴氏消毒→除菌过滤和分装→培育→成品→批签发放行白蛋白生产工艺(2)

混合血浆→FI上清→FII+III上清→FIV上清→FV沉淀→精制→超滤→配制→巴氏消毒→除菌过滤和分装→培育→成品→批签发放行现行生产工艺柱层析法离子交换层析、凝胶过滤和亲和层析法。离子交换层析法：采用不同的pH值和离子强度的缓冲液，使带不同电荷的蛋白质别离。PCC等凝血因子、白蛋白、免疫球蛋白的制备。交换剂如：DEAE-SephadexA-50；DEAE-SepharoseCL-6B；CM-SepharoseCL-6B；Lysine-Sepharose4B；SP-SephadexC-50；Q-SepharoseFF；

三、血液制品的平安性和病毒灭活◆血浆相关病毒的概念◆原料血浆筛查及检疫期管理◆血液制品生产工艺去除病毒能力◆血液制品病毒灭活/去除工艺◆保证血液制品病毒平安性的其他措施原料血浆的特殊性具有潜在的病毒风险，假设获得起始原材料的过程和生产过程控制不严密，可能导致血源性传染病感染：甲型肝炎病毒〔HAV〕乙型肝炎病毒〔HBV〕丙型肝炎病毒〔HCV〕丁型肝炎病毒〔HDV〕艾滋病病毒〔HIV〕巨细胞病毒〔CMV〕人类细小病毒〔HPV〕朊病毒〔CJDV〕其他可通过血液传播的病毒病毒名称大小（nm）

病毒

包膜核酸传播介质全血血液制品乙型肝炎病毒（HBV）42＋DNA

＋＋丙型肝炎病毒（HCV）30-60＋RNA

＋

＋人类免疫缺陷病毒（HIV）100＋RNA

＋

＋人嗜T淋巴细胞病毒（HTLV）90-140＋RNA

＋

＋巨细胞病毒（CMV）200＋DNA＋－EB病毒（EBV）150-180＋DNA＋－甲型肝炎病毒（HAV）27-32－

RNA

＋－丁型肝炎病毒（HDV）28-39＋

RNA

＋＋人细小病毒（HPV）18-26－

DNA

＋

＋克－雅氏病（CJD）蛋白质源性的传染因子（朊蛋白－PrionProtein)埃博拉病毒（Ebola）、西尼罗病毒（West-nile）、SARS病毒、禽流感病毒？？单采血浆站及单采血浆◆血液制品是以人血浆为原料生产的。◆原料血浆来自单采血浆站采集的血浆。◆单采血浆站由血液制品生产企业设置和管理，应遵守?血液制品管理条例?、?单采血浆站根本标准?、?单采血浆站管理方法?和?单采血浆站质量管理标准?等法律法规的相关规定。血浆运输和贮存◆血浆采集后，应在6小时内冻结，置

-20℃以下保存，保存期不超过3年。◆血浆用专用冷藏车在-15℃以下运输。

检验

用国家中检所检定合格的批批检试剂测定HBsAg、HIV抗体、HCV抗体、ALT、梅毒、血浆蛋白、抗-HBs等其他抗体含量。原料血浆血清学的检测：HBsAg抗－HCV抗－HIVALT梅毒原料血浆检疫期◆2021年6月31日后建立原料血浆投料前的“检疫期〞制度.◆血浆采集复检合格后放置90天等献浆员第二次献浆检测合格后投产。减少窗口期传染。◆假设用NAT/PCR检测，“窗口期〞可由90天缩短至60天.三种病毒的窗口期平均天数

ELISANATHCV8223HIV2211HBV5934原料血浆采集管理流程〔浆站〕合格供浆员供浆员注册供血浆者档案查询建立首次供浆者档案新供浆员合格供浆员问询合格？NO拒绝YES体检合格？NOYES血清样本新供浆员

*血清检验合格？NO新供浆员注册YES*血浆采集入浆站血浆库房血浆检测合格供浆员合格？YES拒绝NO运输至血液制品厂家*检测用试剂经国家批批检和入厂确认*采浆耗材经入厂检验合格原料血浆管理〔血液制品生产厂家〕检测试剂SFDA放行检测试剂使用前蓉生确认保存样品血浆采集流程图冷链运输血液制品的病毒平安性控制◆Cohn’s低温乙醇血浆组分法——低温乙醇沉淀法生产工艺中可去除一定量的病毒；◆过滤法——包括用于IVIG的深层过滤，经确证能大量除去脂包膜和非包膜病毒，模型病毒为HBV、HIV、ParvovirusB19、HAV。白蛋白三步沉淀病毒Log减少数StepEthand（%）PHLogReductionFactHIVPRVSindbisBEVStepA195.853.33.74.24.2StepⅣ405.854.45.75.43.6StepD104.60.91.73.11.2IVIG三步沉淀病毒Log减少数StepEthand（%）PHLogReductionFactHIVPRVSindbisBEVStepA195.854.03.63.23.4StepB125.155.34.74.64.1StepC257.04.04.72.93.8StepD2.23.01.72.8血液制品的病毒灭活◆血液制品平安控制◆原料血浆平安控制◆-不同层次的病原体检测方法◆-检疫期制度：排除潜在危险的血浆◆病毒灭活/去除工艺及其效果验证◆生产与质量管理：cGMP◆质量标准与质量控制现行原料血浆的平安控制方法◆原料血浆：单采血浆站提供◆排查：询问病史、体检、献浆员管理系统◆采浆站/血清学检测〔初筛〕：HBsAg、HCV抗体、HIV-1/2抗体、梅毒和ALT◆血液制品生产企业/血清学复检：HBsAg、HCV抗体、HIV-1/2抗体、梅毒和ALT◆检测试剂：国家药品管理当局批准的、中国药品生物制品检定所逐批检定合格的产品原料血浆病毒平安控制体系◆血源性疾病传播的潜在危险/艾滋病等血源性疾病的控制◆现行原料血浆病毒检测方法的灵敏度限制◆-献浆员管理：有效的身份识别系统◆病原体筛选：高灵敏度方法〔NAT〕◆原料血浆“检疫期〞存放：排除病毒检测的窗口期◆-原料血浆跟踪系统：献浆后追踪血浆的检疫期制度◆血浆的检疫期制度是对混浆投料前的原料血浆进行固定时间放置和回忆检验的血浆处理方法。◆-使投料血浆的病毒污染程度降至最低◆-国外企业通常将原料血浆在混浆投料前冷冻放置90天◆-电脑化血浆跟踪系统：跟踪检测结果血液制品的病毒灭活/去除工艺◆病毒灭活的必要性◆病毒的窗口期◆试剂灵敏度限制导致漏检◆人为过失引起漏检◆经血传播尚未检测的病毒：细小病毒B19、巨细胞病毒〔CMV〕◆可能经血传播但尚未检测的病毒病毒灭活/去除工艺◆国家药监局规定：血液制品生产工艺必须包括病毒灭活/去除步骤◆血浆蛋白制品的生产：包括一步或两步病毒灭活/去除工艺步骤◆病毒灭活/去除方法：须经国家药品管理部门批准前方可使用经血液传播的病毒

HBV：双链DNA；脂包膜；40-45nmHCV：单链RNA；脂包膜；40-50nmHIV：单链RNA；脂包膜；80-130nmHAV：单链RNA；非脂包膜28-30nm细小病毒B19：单链DNA；非脂包膜；18-26nm病毒灭活方法：1、巴氏消毒法◆巴氏消毒法〔60℃/10h〕即在60±0.5℃连续加热10-11小时。白蛋白采用这个方法进行病毒灭活，通常是在除菌过滤、分装到最终容器以后进行加热处理。通常，为防止蛋白质变性，在除菌过滤前要参加低浓度的辛酸钠或辛酸钠与N-乙酰色氨酸作为保护剂。几十年的临床使用情况证明，采用低温乙醇法和巴氏灭活方法生产的白蛋白对肝炎病毒和HIV是平安的。2、干热法(80℃/72h)

冻干品加热法蛋白质冻干除去水分以后可以耐受60-80℃或更高温度。在80℃以上加热可以产生令人满意的对HBV、HCV、HIV和HAV的病毒灭活效果。冻干品加热法一般多用于凝血因子类产品。由于冻干后病毒也更稳定，因此，必须进行在规定条件下的病毒灭活验证。冻干品加热法的病毒灭活效果受产品的水分残留量、组成成分如蛋白质、糖、盐和氨基酸的含量以及冰冻与冻干时间的影响。由于病毒灭活对水分残留量特别敏感，因此要根据验证结果设置允许的水分残留限度，并保持瓶间残留水分的差异处于限度内。3、S/D法S/D法TNBP(0.3%)/Cholate(0.2%)〔30℃/6h〕TNBP(0.3%)/Tween-80(1%)〔24℃/6h〕TNBP(0.3%)/Triton-100(1%)〔24℃/4~6h〕有机溶剂与去污剂的混合物〔S/D〕能够破坏包膜病毒的脂膜结构，导致受到破坏的病毒无法与感染细胞结合。但该方法不能灭活非脂包膜病毒。4、低pH法

〔pH：４.00±0.20;24℃,21天〕低pH法在某些酸性条件下,脂包膜病毒可以被灭活。免疫球蛋白经低pH如pH4〕处理，可以有效灭活几种脂包膜病毒。如在免疫球蛋白生产中，通常采用20-22℃，pH4.1培育21天。灭活条件如pH值、孵放时间和温度、胃酶含量、蛋白质浓度、溶质含量等因素，可能影响灭活效果，应确定这些参数允许变化的幅度。5、ＭＢ〔亚甲基蓝〕法１μMMB在白色荧光45000lux照射１小时。MB法已用于临床血浆的病毒灭活6、荧光法补骨脂S-59(150μM)结合UVA(3J/cm2)7、纳米膜过滤法使用20nm或50nm的膜过滤。

8、γ射线法病毒去除方法沉淀层析〔离子交换或亲和层析〕纳米膜过滤血液制品常用病毒灭活方法1.人血白蛋白：巴氏消毒法〔60℃/10小时〕2.IVIG/IMIG〔包括特异性免疫球蛋白〕：-低pH孵放法〔pH4〕-巴氏消毒法-低pH孵放法加纳米膜过滤-巴氏消毒法加低pH孵放法-S/D法3.人凝血因子:-S/D法〔有机溶剂/去污剂〕-S/D法/100℃、30分钟，干热法：80℃、72小时。四、血液制品的质量标准和质量控制质量控制体系◆

-国家批签发管理◆

-检测实验室认证体系质量标准体系◆国家标准

--中国药典

--SFDA标准◆企业标准

--注册标准

--申报标准

--内部考核和放行标准◆参考标准

-WHO、USP、BP、EP平安性有效性稳定性血液制品生产的质量控制平安性原材料的质量控制生产过程中的质量控制成品的质量控制外源性污染的控制平安性原材料的质量控制供给商的质量审核原材料的质量检验平安性生产过程中的质量控制◆生产工艺验证◆防止污染和交叉污染◆防腐剂和稳定剂◆中间品保存和效期◆血液制品生产中应注意的问题平安性成品的质量控制◆成品外观检测◆鉴别试验◆无菌试验◆热原质试验◆异常毒性试验外源性污染的控制

产品单支污染的控制热原的控制

Al3+含量的控制不溶性微粒的控制单支污染的控制自动灌装系统严格的检疫孵放过程分装车间良好的净化控制

热原的控制鲎试验的应用－生产过程，原液，成品微生物限度控制－主要原材料助滤剂，滤板的吸附作用过滤别离的去热原作用全封闭的别离系统降低热原二次污染的时机Al3+含量的控制铝离子的来源：原材料：助滤剂、滤板 内包材：胶塞、瓶子铝离子的去除：超滤 2005年版?中国药典?：人血白蛋白铝离子≦200ug/L不溶性微粒的控制微粒污染的危害注射液中常出现的微粒有：炭黑、碳酸钙、橡胶屑、纤维素、玻璃屑、纸屑、细菌、真菌及芽孢、结晶等。微粒污染的危害：异物微粒引起的病理现象：〔1〕肺肉芽肿和肺水肿；〔2〕静脉炎；〔3〕过敏反响；〔4〕局部组织栓塞与坏死〔5〕肿瘤形成或肿瘤样反响。不溶性微粒的控制微粒污染的来源及控制洁净室内的发尘量，90％左右来自人员，为此，必须采取隔离人体污染的卫生措施。室内微粒的其他污染源空气室内墙体、地面设备、容器物料进入洁净室的物品静脉输注产品渗透压的控制人血白蛋白：渗透压摩尔浓度应为210～360mOsmol/kg。以成品中蛋白浓度为5%～25%〔渗透压理论值约为10～70mOsmol/kg〕、钠离子不得过160mmol/L〔含氯化钠、辛酸钠，n均以1.84计的渗透压理论值为294mOsmol/kg〕计算，本品渗透压理论值最大约360mOsmol/kg，静注人免疫球蛋白〔pH4〕：渗透压摩尔浓度不得低于240mOsmol/kg。〔参考EP〕序号样品渗透压（mOsmol/kg）目测法分光光度法OD值溶血率1阴性对照管（0.9%NaCl）285未溶血0.02920.72%NaCl226未溶血0.023030.63%NaCl201未溶血0.0371.7%40.54%NaCl174微溶血0.08311.6%50.45%NaCl146溶血0.49198.9%60.36%NaCl115

溶血0.49399.4%7阳性对照管溶血0.496100%

有效性免疫球蛋白抗体效价：抗－HBs每克蛋白质应不低于6.0IU;白喉抗体每克蛋白质应不低于3.0HAU;IVIG:Fc活性、IgG亚类齐全；凝血因子活性：凝血因子特异活性应≥1.0IU/mg蛋白；效价或蛋白含量的限量要求:如IVIG的IGg含量应≥50g/L；白蛋白蛋白总量应≥标示量；特免的抗体效价应≥100IU/ml;

1.保持天然的分子结构和完整的识别、效应功能

2.IgG亚类齐全，符合正常人血浆配比。

3.

具有广谱抗体。

4.IgG完整性和Fc段活性的测定如何评价IVIG的有效性

稳定性

指在规定的制剂有效期内，或经过运输、贮存等环境因素影响后，任能到达原规定的合格指标。不同制剂的特殊要求白蛋白类：多聚体〔≤5%〕、引起降压反响的物质〔细菌内毒素<1.67EU/ml、PKA≤35IU/ml〕、外源性污染物〔铝离子≤200ug/L〕；免疫球蛋白类：裂解物含量(分子大小分布≧95%)、抗补体活性(≤50%)、降压物质〔PKA≤35.0IU/ml〕、血型抗体〔抗A、抗B血凝素≤1:64〕、IgA含量；凝血因子类制剂：病毒平安性〔必须有两步病毒灭活工艺〕。血液制品的质量标准和检验项目人血白蛋白静注人免疫球蛋白（pH4)人免疫球蛋白人乙型肝炎免疫球蛋白鉴别试验（免疫双扩散法）仅与抗人的血清产生沉淀线，与抗马、抗牛、抗猪、抗羊血清不产生沉淀线仅与抗人的血清产生沉淀线，与抗马、抗牛、抗猪、抗羊血清不产生沉淀线仅与抗人的血清产生沉淀线，与抗马、抗牛、抗猪、抗羊血清不产生沉淀线仅与抗人的血清产生沉淀线，与抗马、抗牛、抗猪、抗羊血清不产生沉淀线鉴别试验（免疫电泳法）与正常人血清比较，主要沉淀线应为白蛋白与正常人血清比较，主要沉淀线应为IgG与正常人血清比较，主要沉淀线应为IgG与正常人血清比较，主要沉淀线应为IgG外观应为略黏稠、黄色或绿色至棕色澄明液体，不应出现浑浊应为无色或淡黄色澄清液体，可带轻微乳光应为无色或淡黄色澄清液体，可带乳光，不应出现浑浊应为无色或淡黄色澄清液体，可带乳光，不应出现浑浊可见异物应符合规定应符合规定应符合规定应符合规定装量应不低于标示量应不低于标示量应不低于标示量应不低于标示量项目人血白蛋白静注人免疫球蛋白（pH4)人免疫球蛋白人乙型肝炎免疫球蛋白热稳定性试验取供试品置57℃±0.5℃水浴箱中保温50小时后，用可见异物检查装置，与同批未保温的供试品比较，除颜色有轻微变化外，应无肉