补阳还五汤调控Cav1mTORULK1通路介导的自噬抗脑缺血损伤机制研究

补阳还五汤调控Cav1/mTOR/ULK1通路介导的自噬抗脑缺血损伤机制研究缺血性中风是一种严重威胁人类健康的脑血管疾病,具有高发病率、高致死率和高致残率特点,是当前神经科学急需解决的课题。目前,虽然随着诊疗技术的不断提高,但对于该病仍缺乏有效的治疗手段。因此,阐明缺血性中风的发病机制并寻找有效的治疗方法显得尤为紧迫。既往医学界已经达成共识,脑缺血后缺血灶内存在缺血核心区和周围半暗带,核心区细胞死亡方式以坏死为主,为不可逆性损伤,而半暗带内细胞则以凋亡占主导,为可逆性损伤,据此,抑制半暗带内细胞凋亡是该病治疗的关键环节。然而,越来越多研究发现,广谱Caspase抑制剂抗凋亡治疗并未减轻脑缺血所致脑损伤程度。自噬作为一种细胞内溶酶体依赖的降解途径,近年来大量文献报道脑缺血后半暗带内细胞存在明确的自噬现象,并且先于凋亡发生,同时与凋亡存在相互作用,在脑缺血损伤中扮演了重要角色,但其作用尚不明确。因此,进一步观察自噬在脑缺血后半暗带组织中的激活情况及变化规律,同时明确其在脑缺血损伤中的作用,将有助于为缺血性中风的防治寻找新的有效靶点。国内外研究报道小凹蛋白-1（caveolin1,Cav1）参与了肺上皮细胞、乳腺癌等多种细胞自噬的调控,同时,有学者发现Cav1基因敲除加重了脑缺血损伤。那么,Cav1是否参与了脑缺血后半暗带细胞自噬的调控?若参与,其机制又如何?目前尚未阐明。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）/Unc-51-样激酶1（unc-51-likekinase1,ULK1）通路作为脑缺血状态下调控自噬的关键通路,脑缺血后Cav1是否通过mTOR/ULK1通路调控脑缺血后半暗带自噬进而发挥抗脑缺血损伤作用?因此,我们拟在永久性大脑中动脉阻塞（permanentmiddlecerebralarteryocclusion,pMCAO）小鼠模型基础上,通过Cav1基因敲除,在整体动物水平明确Cav1在脑缺血后半暗带自噬中的调控作用及可能机制。补阳还五汤（BuyangHuanwuDecoction,BHD）是清代名医王清任用来治疗中风后半身不遂的经典名方,我们现代常用来治疗缺血性中风,取得了较好的临床疗效。大量研究表明该方具有很好的脑保护作用,但其作用机制尚不完全清楚。因此,进一步证实并阐明该方的抗脑缺血损伤作用及机制,对缺血性中风的防治具有重要的现实意义。本研究主要由四个部分组成。第一部分:基因敲除小鼠鉴定繁育方法的建立,以及Cav1在正常C57BL/6野生型小鼠脑内的表达与定位检测;第二部分:观察脑缺血后半暗带组织中自噬的激活情况及变化规律,同时明确半暗带自噬在脑缺血损伤中的作用;第三部分:阐明Cav1在脑缺血后半暗带自噬调控中的作用及可能机制;第四部分:通过药物预处理的方法,从Cav1/mTOR/ULK1通路介导的自噬角度探讨补阳还五汤抗脑缺血损伤的可能作用机理。第一部分基因敲除小鼠鉴定繁殖方法与Cav1在脑内表达定位目的:探讨Cav1基因敲除小鼠的鉴定方法与最优繁育方式,观察Cav1在正常C57BL/6野生型（wildtype,WT）小鼠脑内的表达与定位情况,为深入研究Cav1在脑缺血损伤中的作用及机制提供理想的动物模型。方法:根据美国杰克逊实验室（JacksonLaboratory）提供的引物序列,运用普通聚合酶链反应（polymeasechainreaction,PCR）法扩增鼠尾基因组DNA、琼脂糖凝胶电泳检测Cav1基因敲除小鼠子代基因型;通过Cav1杂合子互交、杂合子与Cav1纯合子杂交（正交及反交）、纯合子互交4种不同的配种方式,观察亲代小鼠的受孕情况及子代小鼠基因型纯合情况;采用免疫组织化学（immunohis-tochemistry,IHC）法检测Cav1在正常C57BL/6野生型小鼠脑内的表达情况及分布区域。结果:琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物分子量大小约为200bp和661bp,与预期的目的基因片段分子量大小一致,成功鉴定了Cav1基因敲除小鼠的不同基因型;杂合子互交、杂合子与纯合子正交及反交、纯合子互交四种不同繁殖方式所产子代小鼠的基因型分布基本符合孟德尔遗传定律,子代小鼠纯合率分别为23.52%、47.36%、52.54%、100.00%;雌性、雄性Cav1基因敲除纯合鼠具有一定的繁殖能力,杂合子互交雌鼠受孕率为100.00%,杂合子与纯合子正交、反交雌鼠受孕率均为87.50%,纯合子互交雌鼠受孕率为75.00%,杂合子互交与其余三种繁殖方式的雌鼠受孕率比较,差异均具有统计学意义（P均﹤0.05,n=8）;Cav1表达部位主要位于细胞膜及细胞浆,在神经元、神经胶质细胞、内皮细胞中均可见其表达,神经细胞中尤其丰富,广泛分布于皮层、纹状体、室管膜下区、海马等区域。结论:普通PCR法能够快速可靠鉴定Cav1基因敲除小鼠的基因型;杂合子小鼠互交与纯合子互交相结合的繁殖方法可能是短期内获得足量Cav1纯合子子鼠与同源野生子鼠的较好方式;Cav1在正常C57BL/6野生型小鼠脑内表达丰富。第二部分自噬在脑缺血后半暗带组织中激活情况及作用目的:观察局灶性脑缺血后半暗带组织中自噬激活情况及变化规律,明确半暗带自噬在脑缺血损伤中的作用,为缺血性中风的防治寻找新的有效靶点。方法:采用pMCAO法复制局灶性脑缺血模型。将C57BL/6野生型小鼠随机分为假手术（Sham）组和模型（Model）组,在脑缺血后3h、6h、12h及24h,应用免疫印迹（westernblot,WB）检测各个时间点小鼠脑缺血后半暗带皮层组织自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associatedprotein1lightchain3,LC3）亚型LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及泛素结合蛋白P62（sequestosome1,SQSTM1）的表达,同时使用透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscopy,TEM）观察半暗带皮层组织自噬体（autophagome,AP）数量变化,以阐明脑缺血后半暗带组织内自噬的激活情况及变化规律;为了进一步明确半暗带自噬在脑缺血损伤中的作用,我们通过自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）和自噬诱导剂雷帕霉素（Rapamycin）双向调控自噬的方法,将C57BL/6野生型小鼠随机分为Sham、Model、3-MA、Rapamycin和5%二甲基亚砜（dimethylsulfoxide,DMSO）组,相应给以3-MA(15mg·kg^-1·d^-1)、Rapamycin(6mg·kg^-1·d^-1)及5%DMSO腹腔注射预处理7d,分别在脑缺血后3h、6h、12h及24h四个时间点评价其神经功能,造模后自噬高峰时间点采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,TTC）染色测定脑梗死体积并计算其相对梗死体积、苏木素伊红（hematoxylinandeosin,HE）染色观察半暗带皮层组织病理形态变化、WB检测自噬标记蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及P62表达、TEM观察AP数量。结果:（1）自噬在脑缺血后半暗带组织中激活情况为了观察脑缺血后半暗带组织中自噬的激活情况及变化规律,我们通过WB和TEM技术,检测了C57BL/6野生型小鼠pMCAO术后3h、6h、12h及24h四个时间点脑缺血半暗带皮层组织自噬水平。WB结果显示:与Sham组比较,Model组四个时间点LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显上调（P均<0.05,n=4）,P62表达均明显下调（P均<0.05,n=4）;与pMCAO3h比较,pMCAO6hLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值进一步上调（P<0.05,n=4）,P62表达进一步下调（P<0.05,n=4）;与pMCAO6h比较,pMCAO12hLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下调（P<0.05,n=4）,P62表达则上调（P<0.05,n=4）;与pMCAO12h比较,pMCAO24hLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、P62表达无显著性差异（P>0.05,n=4）。TEM结果显示:Sham组仅可见少量AP形成;与Sham组比较,Model组四个时间点AP数量均明显增加（P均<0.05,n=4）;与pMCAO3h比较,pMCAO6hAP数量进一步增加（P<0.05,n=4）;与pMCAO6h比较,pMCAO12hAP数量减少（P<0.05,n=4）;与pMCAO12h比较,pMCAO24hAP数量无显著性差异（P>0.05,n=4）。以上结果表明,局灶性脑缺血后半暗带组织中自噬被激活,缺血后3h上调,6h达到高峰,12h开始下调,24h仍维持较高水平,具有明显的动态变化规律。（2）半暗带自噬在脑缺血损伤中的作用为了明确半暗带自噬在脑缺血损伤中的作用,我们通过自噬抑制与自噬诱导双向调控自噬的方法,运用神经功能评分、TTC染色、HE染色、WB及TEM技术分别检测了pMCAO术后3h、6h、12h及24h四个时间点小鼠的神经功能,造模后自噬高峰6h相对脑梗死体积、半暗带皮层组织病理形态、自噬标记蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值与P62表达以及AP数量。神经功能评分结果显示:与Sham组相同时间点比较,Model组pMCAO术后四个时间点神经功能缺损评分均明显升高（P均<0.05,n=4）;与Model组相同时间点比较,3-MA组pMCAO术后四个时间点神经功能缺损评分均明显降低（P均<0.05,n=4）、Rapamycin组均明显升高（P均<0.05,n=4）、5%DMSO组均无显著性差异（P均>0.05,n=4）。TTC染色结果显示:正常脑组织呈鲜红色,梗死脑组织呈白色;与Sham组比较,Model组相对脑梗死体积明显增加（P<0.05,n=4）;与Model组比较,3-MA组相对脑梗死体积明显减少（P<0.05,n=4）、Rapamycin组明显增加（P<0.05,n=4）、5%DMSO组均无显著性差异（P>0.05,n=4）。HE染色结果显示:假手术组皮层脑组织形态正常,结构清晰、排列整齐,神经元胞体呈圆形或梭形,胞核较大、染色较浅,核仁清楚、核膜完整,胶质细胞胞核较小、染色较深,神经纤维走形一致、间质染色均匀。与Sham组比较,Model组半暗带皮层组织形态出现明显缺血后病理改变,组织结构紊乱,神经元数量减少、排列不齐、细胞周围间隙增宽,部分胞体皱缩变性呈嗜酸性改变、核固缩深染、细胞形态变成三角形或长条形,少量胶质细胞聚集,神经纤维走形紊乱,间质水肿、染色淡,但仍可见部分基本正常的神经元;与Model组比较,3-MA组病理形态改善、Rapamycin组病理形态恶化、5%DMSO组无显著差异。WB结果显示:与Sham组比较,Model组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显上调（P<0.05,n=4）,P62表达明显下调（P<0.05,n=4）;与Model组比较,3-MA组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下调（P<0.05,n=4）、P62表达则上调（P<0.05,n=4）,Rapamycin组与3-MA组相反（P均<0.05,n=4）,5%DMSO组无显著差异（P均>0.05,n=4）。TEM结果显示:Sham组仅可见少量AP形成;与Sham组比较,Model组AP数量明显增加（P<0.05,n=4）;与Model组比较,3-MA组AP数量减少（P<0.05,n=4）,Rapamycin组与3-MA组相反（P<0.05,n=4）,5%DMSO组无显著差异（P>0.05,n=4）。以上结果表明,自噬抑制剂3-MA预处理能够通过抑制脑缺血后半暗带皮层组织LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化及P62蛋白降解,减少AP形成,下调半暗带皮层组织自噬水平,来降低脑缺血小鼠神经功能缺损评分、减少其相对脑梗死体积、改善半暗带皮层组织病理形态,发挥脑保护作用;而自噬诱导剂Rapamycin预处理却得到相反的结果,加重了局灶性脑缺血所导致的脑损伤。结论:自噬在局灶性脑缺血后半暗带组织中被激活,且具有明显的动态变化规律;半暗带自噬在永久性脑缺血损伤中扮演了损害者的角色。第三部分Cav1通过mTOR/ULK1通路调控脑缺血后半暗带自噬目的:明确Cav1在脑缺血后半暗带自噬调控中的作用及可能分子机制,进一步丰富人们对脑缺血损伤自噬机理的认识,为临床防治缺血性中风提供潜在的分子靶标。方法:采用pMCAO法建立局灶性脑缺血模型。将Cav1基因敲除（caveolin1knockout,Cav1KO）小鼠与同源WT小鼠分别随机分为Sham组与Model组,在脑缺血造模后自噬高峰6h,应用WB检测小鼠半暗带皮层组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及P62的表达、TEM观察AP数量变化,以明确Cav1在脑缺血后半暗带自噬调控中的作用;为了进一步阐明Cav1调控脑缺血后半暗带自噬的分子机制,我们运用WB检测了脑缺血后半暗带皮层组织mTOR、p-mTOR（Ser2448）与ULK1、p-ULK1（Ser757）蛋白表达水平,同时采用IHC进一步检测了p-mTOR（Ser2448）与p-ULK1（Ser757）蛋白表达,实时荧光定量PCR（realtimequantitativePCR,RT-qPCR）检测了mTOR与ULK1mRNA的表达变化。结果:（1）Cav1在脑缺血后半暗带自噬调控中的作用为了明确Cav1在脑缺血后半暗带自噬调控中的作用,我们利用WT和Cav1KO小鼠,通过WB与TEM技术,检测了pMCAO术后6h小鼠脑缺血半暗带皮层组织自噬水平。WB结果显示:与WTSham组比较,Cav1KOSham组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值与P62蛋白表达均无显著性差异（P均>0.05,n=4）,WTModel组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显上调（P<0.05,n=4）,P62蛋白表达明显下调（P<0.05,n=4）;与WTModel组比较,Cav1KOModel组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值进一步上调（P<0.05,n=4）,P62蛋白表达进一步下调（P<0.05,n=4）。TEM结果显示:WTSham组皮层半暗带组织细胞内仅可见少量AP形成;与WTSham组比较,Cav1KOSham组AP数量无显著性差异（P>0.05,n=4）,WTModel组AP数量明显增加（P<0.05,n=4）;与WTModel组比较,Cav1KOModel组AP数量进一步增加（P<0.05,n=4）。以上结果表明,Cav1基因敲除并不影响正常状态下脑组织自噬水平,但能够促进局灶性脑缺血后半暗带皮层组织LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化及P62蛋白降解,增加AP数量,上调半暗带组织自噬水平。（2）Cav1调控脑缺血后半暗带自噬的分子机制为了进一步阐明Cav1调控脑缺血后半暗带自噬的分子机制,我们运用WB、IHC及RT-qPCR技术检测了小鼠pMCAO术后6h脑缺血半暗带皮层组织mTOR、p-mTOR（Ser2448）与ULK1、p-ULK1（Ser757）蛋白表达水平及mTOR、ULK1mRNA表达水平。WB结果显示:与WTSham组比较,Cav1KOSham组mTOR、p-mTOR（Ser2448）与ULK1、p-ULK1（Ser757）蛋白表达均无显著性差异（P均>0.05,n=4）,WTModel组p-mTOR（Ser2448）与p-ULK1（Ser757）蛋白均表达下调（P均<0.05,n=4）,而mTOR与ULK1蛋白表达则无显著性差异（P均>0.05,n=4）;与WTModel组比较,Cav1KOModel组p-mTOR（Ser2448）与p-ULK1（Ser757）蛋白表达进一步下调（P均<0.05,n=4）,而mTOR与ULK1蛋白表达也无显著性差异（P均>0.05,n=4）。IHC结果显示:WTSham组皮层脑组织可见大量p-mTOR（Ser2448）与p-ULK1（Ser757）阳性细胞,二者均主要表达于细胞浆;与WTSham组比较,Cav1KOSham组p-mTOR（Ser2448）与p-ULK1（Ser757）阳性细胞数及平均光密度（Meanopticaldensity,MOD）均无显著性差异（P均>0.05,n=4）,WTModel组p-mTOR（Ser2448）、p-ULK1（Ser757）阳性细胞数与MOD均减少（P均<0.05,n=4）;与WTModel组比较,Cav1KOModel组p-mTOR（Ser2448）、p-ULK1（Ser757）阳性细胞数与MOD进一步减少（P均<0.05,n=4）;IHC结果与WB结果一致。RT-qPCR结果显示:与WTSham组比较,Cav1KOSham组与WTModel组mTOR、ULK1mRNA表达均无显著性差异（P均>0.05,n=4）;与WTModel组比较,Cav1KOModel组mTOR、ULK1mRNA表达亦均无显著性差异（P均>0.05,n=4）;二者结果与蛋白水平表达结果一致。以上结果表明,Cav1基因敲除并不影响正常状态下脑组织mTOR与ULK1蛋白、mRNA及关键位点的磷酸化水平,但能下调局灶性脑缺血后半暗带皮层组织p-mTOR（Ser2448）与p-ULK1（Ser757）蛋白表达,而对mTOR与ULK1蛋白及mRNA表达则无影响。结论:Cav1对脑缺血后半暗带自噬具有明确的调控作用;通过使p-mTOR（Ser2448）与p-ULK1（Ser757）磷酸化程度维持在一定水平,影响mTOR/ULK1通路活性,可能是Cav1调控脑缺血后半暗带自噬的分子机制。第四部分补阳还五汤调控Cav1/mTOR/ULK1通路介导的自噬抗脑缺血损伤机制目的:从Cav1/mTOR/ULK1通路介导的自噬探讨补阳还五汤抗脑缺血损伤机制,为临床运用该方防治缺血性中风提供实验依据。方法:通过药物预处理的方法,运用Cav1基因敲除与Rapamycin双重阻断Cav1/mTOR/ULK1通路诱导细胞自噬,阐明补阳还五汤抗脑缺血损伤的自噬机制。将C57BL/6WT小鼠随机分为Model组、BHD组及BHD+Rapamycin组,Cav1KO小鼠随机分为BHD组及BHD+Rapamycin组,相应给以Rapamycin(6mg·kg^-1·d^-1)腹腔注射诱导细胞自噬及补阳还五汤(18.5g·kg^-1·d^-1)灌胃给药预处理7d,采用pMCAO法复制局灶性脑缺血模型,分别在脑缺血后3h、6h、12h及24h四个时间点评价其神经功能,造模后自噬高峰6h运用TTC染色测定脑梗死体积并计算其相对梗死体积、HE染色观察半暗带皮层组织病理形态变化、WB检测自噬标记蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及P62表达、TEM观察AP数量。为了进一步阐明补阳还五汤调控脑缺血后半暗带自噬的分子机制,我们运用WB检测了脑缺血后半暗带皮层组织mTOR、p-mTOR（Ser2448）与ULK1、p-ULK1（Ser757）蛋白表达水平,同时采用IHC进一步检测了p-mTOR（Ser2448）与p-ULK1（Ser757）蛋白表达,RT-qPCR检测了mTOR与ULK1mRNA表达变化。结果:（1）补阳还五汤抗脑缺血损伤的自噬机理为了明确补阳还五汤脑保护作用与脑缺血后半暗带细胞自噬水平的关系,我们检测了pMCAO术后3h、6h、12h及24h四个时间点小鼠的神经功能,造模后6h相对脑梗死体积、半暗带皮层组织病理形态、自噬标记蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值与P62表达及AP数量。神经功能评分结果显示:与WTModel组相同时间点比较,WTBHD组pMCAO术后四个时间点神经功能缺损评分均明显降低（P均<0.05,n=4）;与WTBHD组相同时间点比较,pMCAO术后四个时间点WTBHD+Rapamycin组、Cav1KOBHD组与Cav1KOBHD+Rapamycin组神经功能缺损评分均不同程度增加（P均<0.05,n=4）,其中Cav1KOBHD+Rapamycin组增加更明显（P<0.05,n=4）。TTC染色结果显示:正常脑组织呈鲜红色,缺血脑组织呈白色;与WTModel组比较,WTBHD组相对脑梗死体积明显减少（P<0.05,n=4）;与WTBHD组比较,WTBHD+Rapamycin组、Cav1KOBHD组与Cav1KOBHD+Rapamycin组相对脑梗死体积均不同程度增加（P均<0.05,n=4）,其中Cav1KOBHD+Rapamycin组增加更明显（P<0.05,n=4）。HE染色结果显示:WTModel组半暗带皮层组织形态出现明显缺血后病理改变,组织结构紊乱,神经元数量减少、排列不齐、细胞周围间隙增宽,部分胞体皱缩变性呈嗜酸性改变、核固缩深染、细胞形态变成三角形或长条形,少量胶质细胞聚集,神经纤维走形紊乱,间质水肿、染色淡,但仍可见部分基本正常的神经元;与WTModel组比较,WTBHD组病理形态改善,可见皮层半暗带区核固缩细胞较模型组明显减少,细胞形态明显改善,细胞排列较整齐,核较清晰,细胞间隙染色较均匀;与WTBHD组比较,WTBHD+Rapamycin组、Cav1KOBHD组与Cav1KOBHD+Rapamycin组病理形态不同程度恶化,且Cav1KOBHD+Rapamycin组恶化更明显。WB结果显示:与WTModel组比较,WTBHD组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显下调（P<0.05,n=4）,P62表达明显上调（P<0.05,n=4）;与WTBHD组比较,WTBHD+Rapamycin组、Cav1KOBHD组与Cav1KOBHD+Rapamycin组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值不同程度上调（P均<0.05,n=4）,P62表达则不同程度下调（P均<0.05,n=4）,其中Cav1KOBHD+Rapamycin组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和P62蛋白表达变化更明显（P均<0.05,n=4）。TEM结果显示:WTModel组皮层半暗带组织细胞内可见大量AP形成;与WTModel组比较,WTBHD组AP数量明显减少（P<0.05,n=4）;与WTBHD组比较,WTBHD+Rapamycin组、Cav1KOBHD组与Cav1KOBHD+Rapamycin组AP数量均不同程度增加（P均<0.05,n=4）,其中Cav1KOBHD+Rapamycin组增加更明显（P<0.05,n=4）。以上结果表明,补阳还五汤预处理能够通过抑制脑缺血后半暗带皮层组织LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化及P62蛋白降解,减少AP形成,下调半暗带皮层组织自噬水平,来降低脑缺血小鼠神经功能缺损评分、减少其相对脑梗死体积、改善半暗带皮层组织病理形态,发挥脑保护作用,而加用自噬诱导剂Rapamycin或/和基因敲除Cav1则能不同程度地抵消该作用。（2）补阳还五汤调控脑缺血后半暗带自噬的分子机制为了进一步