丙泊酚对卵巢癌SKOV3细胞增殖、侵袭、转移能力的影响及分子机制的研究

丙泊酚对卵巢癌SKOV3细胞增殖、侵袭、转移能力的影响及分子机制的研究除心脑血管疾病之外,恶性肿瘤是引起人类死亡的另一主要死因,有数据资料显示,每年在全球范围内恶性肿瘤造成700万人死亡[1]。在肿瘤患者接受肿瘤切除术、非肿瘤切除手术、及其他非手术治疗过程中,肿瘤微环境(TumorMicroenvironment)及手术预后均有可能受到各种应激创伤的影响。尽管麻醉学科在肿瘤患者围手术期的作用尚未得到人们更深刻的认识,但越来越多的研究[2-4]发现,麻醉药物和应激反应可直接对肿瘤细胞生物学活性产生影响,同时围术期免疫功能的抑制亦可间接与肿瘤细胞生物学活性改变产生相关性。女性健康深受卵巢癌的威胁,其病程的进展与细胞信号通路及相关蛋白异常表达有关。而目前研究较多的标志蛋白有基质金属蛋白酶(MatrixMetalloproteinase,MMPs)、细胞外信号调节激酶(Extracellular-signalRegulatedKinase,ERK1/2)、血管内皮生长因子(VescularEndothelialGrowthFactor,VEGF)、E-钙粘素(E-Cadherin,E-Cad)、以及缺氧诱导因子(Hypoxia-inducibleFactor-1α,HIF-1α)等[5-6]。由于卵巢癌患者早期缺乏特异性体征,临床发现时已较晚,因此往往失去手术机会。此外,卵巢癌还具有临床疗效差、复发转移率高、5年生存率偏低等特点[7]。随着对高危因素的评估筛查、多种诊断方法的联合应用、微创技术以及多学科联合治疗的推进,卵巢癌的防治工作有所改观,早期诊断机率显著提高的同时改善了愈后[8]。结合卵巢癌易复发、转移、分子机制复杂等特点,提示诊疗过程中的每一个环节均应该被关注。关于麻醉实施对肿瘤预后的影响实际上在上世纪已经引起了关注,但是相关研究较少,回顾目前麻醉学与肿瘤学研究的现状发现,麻醉药物对肿瘤细胞生物学影响的体外研究成为热点,并且丙泊酚是主要的代表药物。丙泊酚作为卵巢癌患者围术期经常用到的麻醉药物,仅仅关注其在应激调控、麻醉药物对比观察等方面的研究是远远不够的。在既往麻醉学与肿瘤学研究的基础上,揭示探讨丙泊酚对卵巢癌生物学特性影响的必要性和重要性,从麻醉学角度探讨该患者群体在接受手术、非手术镇静及特定医疗条件下(ICU病人及部分吸食毒品患者)对丙泊酚需求时的用药方案制定,同时减少或者干预其对肿瘤微环境的影响意义深远。关于丙泊酚[9-10]抗炎作用、免疫调控作用的文献报道较多,同时基于其在术中、麻醉后恢复室(PostanesthesiaCareUnit,PACU)、以及危重病房(IntensiveCareUnit,ICU)的应用提示了丙泊酚与临床联系的密切性,是理想的麻醉学药物研究的代表。进一步研究丙泊酚的应用与肿瘤发生、发展的关系及内部相关的分子机制具有重要的代表意义,亦是近年来的研究热点。首先丙泊酚和肿瘤学的相关性研究可为麻醉学与肿瘤学探讨提供方法依据、积累理论数据、从而推动麻醉学与肿瘤学科的交叉研究;其次,对肿瘤患者术中麻醉用药、术后ICU镇静用药,尤其对合并有肿瘤的危重患者呼吸机治疗下镇静用药有重要的指导作用;同时,对于由于种种原因需要主动或者被动长期应用丙泊酚的患者,丙泊酚与肿瘤进展关系及相关分子机制的研究对于麻醉医生判断疾病发展、参与麻醉诊疗提供参考。体外基础实验及已知的初步数据及相关结论证明丙泊酚对于肿瘤细胞的活性有着重要影响,但是该影响的性质与肿瘤细胞的类型及分化程度关系密切,对不同类型肿瘤的生物学活性影响可以完全不同,例如在对乳腺癌、膀胱癌及神经纤维瘤细胞增殖方面的观察发现,丙泊酚所发挥的作用完全相反[3-4],这种相互矛盾的影响使得进一步的研究更为必要。另外,关于丙泊酚对于卵巢癌生物活性影响及内部相关的分子机制却鲜有报道。本研究采用体外培养卵巢癌SKOV3细胞的方法,检测丙泊酚对其活性行为的影响;同时通过测定丙泊酚应用前后细胞内部信号分子表达及活性的变化从而确定丙泊酚影响卵巢癌细胞的分子机制。根据实验设计的需要,将实验对象随机分为5组,包括正常培养对照组、脂肪乳组、低浓度丙泊酚组、及不同高浓度丙泊酚组。本研究内容共分三部分,第一部分将观察各组细胞的细胞活力、细胞凋亡率以及细胞的迁移、侵袭变化是否存在差异。所采用的实验方法:通过CCK8实验观察丙泊酚对卵巢癌SKOV3细胞活力的影响;通过流式细胞技术观察丙泊酚对SKOV3细胞凋亡的影响;而迁移、侵袭方面的观察采用划痕及Transwell实验;课题第二部分主要是探讨丙泊酚对SKOV3细胞生物活性影响的相关分子机制,通过Westernblot技术检测SKOV3各组细胞ERK1/2、MMP-2、MMP-9的表达情况,同时通过微小RNA(SmallinterferingRNA,siRNA)干扰技术,观察ERK1/2的表达水平与MMP-2/9的活性和表达是否存在关联,探讨ERK1/2-MMP-2/9信号通路在丙泊酚对于卵巢肿瘤细胞生物行为的影响中是否扮演着极为重要的角色(图32);课题第三部分探讨丙泊酚对于其他与卵巢癌细胞恶性行为相关的重要分子,主要检测各组细胞VEGF、E-Cad的表达改变,进一步探讨丙泊酚/卵巢癌细胞相互作用可能存在的多种分子机制。采纳Graphpadprism5.0软件包对所检测指标进行统计学分析,并且检验水准以α=0.05(双侧)为标准,而P<0.05表示差异有统计学意义。第一部分丙泊酚对卵巢癌SKOV3增殖、侵袭、转移能力的影响目的探讨丙泊酚对体外培养的人卵巢癌SKOV3细胞增殖及侵袭、转移能力的影响方法对体外培养的人卵巢癌SKOV3细胞进行随机分组:C组(对照组)、F组(脂肪乳组)、P25组为25μmol/L丙泊酚组)、P50组(50μmol/L丙泊酚组),P100组(100μmol/L丙泊酚组);采用CCK8实验检测各组细胞在24h、48h、72h时的OD值,通过流式细胞技术观察5组细胞在24h时的凋亡率,通过划痕实验及Transwell迁移/侵袭实验观察5组细胞在24h时的迁移、侵袭变化情况。结果1、CCK8实验结果显示:C组、F组、P25组、P50组、P100组在各时间点(24h、48h、72h)的OD值(450nm)差异有显著性(F时间=1610,P<0.001;F浓度=180.5,P<0.001;F交互=4.0,P<0.001),其中C组、F组、P25组三组之间各时间点OD值差异均无统计学意义(P>0.05),P50组、P100组各时间点(24h、48h、72h)的OD值均高于F组、C组、P25组(P<0.001),P100组各时间点(24h、48h、72h)OD值均高于P50组(P<0.01)。。2、流式细胞技术:实验设定的五组细胞在24h时的凋亡率存在差异,且差异有显著性(F=277.60,P<0.001),其中C组、F组、P25组三组之间分别比较,在24h时的凋亡率均无差异(P>0.05),而P50组、P100组在24h时的凋亡率分别低于C组、F组、P25组(P<0.001),P100组在24h时的凋亡率低于P50组,但凋亡率差异无显著性(P>0.05)。3、划痕实验结果:C组、F组、P25组、P50组、P100组细胞在24h时的划痕迁移率存在差异,且差异有显著性(F=664.3,P<0.001),其中C组、F组、P25组三组之间分别比较,在24h时的划痕迁移率差异均无显著性(P>0.05),P50组、P100组在24h时的细胞划痕迁移率分别高于C组、F组、P25组进行比较(P<0.001),P1oo组虽高于P50组,但是两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。4、Transwell迁移实验结果:C组、F组、P25组、P50组、P100组细胞在24h时的细胞迁移数存在差异,且差异有显著性(F=254.7,P<0.001),其中C组、F组、P25组三组之间分别比较,在24h的迁移数差异均无显著性(P>0.05),P50组、P100组分别与C组、F组、P25组进行对比,细胞迁移数增多(P<0.001),P100组在24h时的细胞迁移数多于P50组(P<0.05)。5、Transwell-matrigel侵袭实验结果:C组、F组、P25组、P50组、P100组细胞在24小时Transwell细胞侵袭数存在差异,且五组之间差异具有统计学意义(F=160.0,P<0.001),其中C组、F组、P25组三组之间分别比较,每两组细胞侵袭数差异均无统计学意义(P>0.05),P50组、P100组分别与C组、F组、P25组进行对比,侵袭数均增多(P<0.001),P100组在24h时的细胞侵袭数多于P50组(P<0.05)。结论丙泊酚能够增强卵巢癌SKOV3细胞增殖、抑制其凋亡,并且与丙泊酚的药物浓度、以及作用时间有一定相关性;丙泊酚能够增强卵巢癌SKOV3细胞侵袭、迁移能力,且呈浓度相关性;低浓度丙泊酚对SKOV3细胞增殖、凋亡、侵袭、及迁移能力无影响。第二部分ERK1/2-MMP-2/9信号通路在丙泊酚促进卵巢癌SKOV3增殖及侵袭、转移作用中的研究目的探讨ERK1/2-MMP-2/9信号通路在丙泊酚促进SKOV3细胞增殖、凋亡、侵袭、转移的分子机制研究。方法通过Westernblot实验技术检测五组细胞ERK1/2、MMP-2、MMP-9表达变化情况,并且通过siRNA干扰技术观察丙泊酚对ERK1/2-MMP-2/MMP-9信号通路的调控变化,探讨丙泊酚干预下的作用机制。结果1、C组、F组、P25组、P50组、P100组细胞ERK1/2、MMP-2、MMP-9表达均存在差异,且五组之间差异均有显著性(FERK1/2=226.31,P<0.001;FMMP-2=383.2,P<0.001;FMMP-9=215.1,P<0.001);在丙泊酚刺激SKOV310分钟和30分钟后,不同浓度的丙泊酚对于ERK1/2通路有激活作用,且差异有显著性(F=568.9,P<0.001),10分钟时高浓度组(P100组)增加了ERK1/2的磷酸化,30分钟时P50组、P100组ERK1/2磷酸化更为明显(P<0.01);2、C组、F组、P25组三组之间分别比较,ERK1/2、MMP-2、MMP-9表达差异均无显著性,均无统计学意义(P>0.05);3、P50组、P100组ERK1/2、MMP-2、MMP-9表达均高于C组、F组、P25组(P<0.01);4、P100组ERK1/2表达高于P50组,且差异均有显著性,均具有统计学意义(P<0.05),P100组MMP-2、MMP-9的表达与P50组差异均无显著性,均不具有统计学意义(P>0.05);5、对于ERKsiRNA处理过的细胞,丙泊酚不能有效上调MMP-2、MMP-9的表达(P>0.05),然而对于对照siRNA处理后的细胞,丙泊酚能够升高MMP-2及MMP-9的表达(P<0.05);6、ERKsiRNA处理过的各组细胞OD值存在差异,呈增高趋势(F时间=44.8,P<0.01;F浓度=184.4,P<0.01;F交互=3.239,P<0.01);凋亡率呈降低趋势(F=305.1,P<0.01);划痕实验迁移率呈增高趋势(F=239.1,P<0.001),Transwell迁移/侵袭数均呈增高趋势(F=256.5,P<0.001;F=304.6,P<0.001)。结论1、丙泊酚能够上调卵巢癌SKOV3细胞表达ERK1/2、MMP-2/9并且与丙泊酚的药物浓度有一定相关性;2、丙泊酚能够上调卵巢癌SKOV3细胞表达ERK1/2,并且通过ERK1/2促进MMP-2及MMP-9的表达进而影响SKOV3细胞增殖、侵袭及迁移,ERK1/2siRNA的干预进一步证实了丙泊酚引发的ERK1/2-MMP通路的存在;3、低浓度丙泊酚对卵巢癌SKOV3表达ERK1/2及MMP-2/9无影响;4、在ERKsiRNA干预下,丙泊酚对SKOV3细胞增殖及侵袭、迁移活性有影响作用。第三部分VEGF、E-cadehesion在丙泊酚促进卵巢癌SKOV3增殖及侵袭、转移中的作用目的探讨VEGF、E-cadehesion表达在丙泊酚促进SKOV3细胞增殖及侵袭、转移作用中的分子机制研究方法基于Westernblot实验技术,检测在丙泊酚干预下,各组SKOV3细胞表达VEGF、E-cadherin(TGFβ-1干预前后)的变化,探讨丙泊酚对SKOV3生物学活性影响的可能机制。结果1、C组、F组、P25组、P50组、P10组细胞VEGF、E-cadherin(TGF-β1干预后)表