新型AMPA受体调节剂抗呼吸抑制作用及机制研究

新型AMPA受体调节剂抗呼吸抑制作用及机制研究镇静、镇痛和麻醉类药物（如吗啡、芬太尼、丙泊酚等）是临床常用药物,广泛用于急慢性疼痛治疗、辅助诱导麻醉和静脉复合麻醉等。该类药物发挥效应时均不可避免的产生呼吸抑制而成为致死的重要原因。目前用于急救镇静、镇痛和麻醉类药物所致呼吸抑制的首选治疗药是相应靶点的拮抗剂（如纳洛酮、氟马西尼等）。但拮抗时普遍存在给药方式单一、持续时间短、剂量不可控、需长时间密切观察等缺点,更重要的是拮抗剂是靶向治疗药物,在未明确致呼吸抑制药（毒）物类型时,无法第一时间选择相应拮抗剂进行治疗,从而错过急救时机。呼吸兴奋剂（尼可刹米、洛贝林等）是非特异性抗呼吸抑制剂,但该类药物存在安全范围窄、作用时间短、不良反应多等弊端。因此,研制呼吸抑制的非特异性对症治疗药物对镇静、镇痛和麻醉类药物的安全使用,提升临床急救能力具有重要意义。近几年众多文献报道调节AMPA受体可调控呼吸功能,AMPA受体在延髓呼吸中枢的前包钦格复合体广泛分布,对呼吸节律的形成和呼吸冲动的传导发挥着关键作用;且已证实以Ampakine为代表的AMPA受体调节剂可以对抗多种药（毒）物所致的呼吸抑制。AMPA受体调节剂潜在的镇痛效应,改善学习记忆,神经保护等作用可以使救治预后更好,因此AMPA受体调节剂有望成为非特异性抗呼吸抑制药物,其广谱作用特性与拮抗剂或呼吸兴奋剂相比具有显著优势。基于此,本所药物化学研究室合成了一系列全新结构AMPA受体正向调节剂,本室经过抗呼吸抑制药效学筛选,已初步证实LCX001具有抗呼吸抑制作用和镇痛效应。为了进一步明确LCX001抗呼吸抑制作用是否具有广谱性,本研究采用阿片类、中枢抑制剂和麻醉药致呼吸抑制的动物模型,采用整体动物肺功能检测方法观察LCX001抗呼吸抑制作用的广谱性和非特异性作用特点。其次,为了解决LCX001水溶性较差及血脑屏障透过率低的问题,基于LCX001化学结构,进行脑靶向前药化改造以提升血脑屏障透过率和中枢分布,并对所得化合物进行了初步的抗呼吸抑制效应的筛选和药效评价,以期获得更为强效和安全的AMPA受体正向调节剂。最后,鉴于AMPA受体的膜定位程度和通道开放状态决定了AMPA受体的功能强弱,而这两个关键过程都受到转运蛋白的调控,我们利用电生理和细胞成像等技术测定了LCX001对转运调控蛋白stargazin表达的影响,观察其导致AMPA受体（不同亚基）的膜定位程度的变化,并进一步考察该变化对AMPA通道的开放状态产生的影响,最终导致的神经元Ca²⁺内流和细胞整体功能的变化来解释LCX001正向调节AMPA受体功能的作用特点和抗呼吸抑制的作用机制。研究目的:确证新型化合物LCX001抗呼吸抑制的作用特点和正向调节作用机制。研究方法:1.LCX001抗呼吸抑制广谱性评价:采用清醒无创全身体积描记法记录LCX001对阿片类（芬太尼、TH-030418）、丙泊酚和戊巴比妥等致呼吸抑制大鼠肺功能参数（呼吸频率、通气量）的影响。2.LCX001脑靶向前药抗呼吸抑制药效筛选和评价:选择强效阿片激动剂TH-030418建立小鼠急性致死模型,筛选出可显著提高小鼠存活率的LCX001脑靶向前药化合物,通过考察候选化合物对阿片致模型小鼠急性毒性LD₅₀剂量的影响、对改善模型大鼠呼吸抑制效应的时效量效研究、对动脉血氧饱和度、二氧化碳分压、pH的影响等方法综合评价候选化合物改善呼吸抑制的效应,并与LCX001进行比较研究。3.LCX001对AMPA受体转运和突触定位的作用:3.1蛋白免疫印迹实验考察LCX001处理对AMPA转运调控蛋白stargazin蛋白表达的影响。3.2用细胞免疫荧光直接观察和活细胞成像技术动态观察LCX001引发pH敏感性荧光蛋白标记的AMPA受体在细胞膜表面分布定位的变化,考察LCX001上调转运调控蛋白stargazin对AMPA受体转运定位的影响;4.LCX001对AMPA离子通道开放特性和细胞兴奋性的作用:采用膜片钳全细胞记录的方式研究LCX001对谷氨酸激活AMPA-GluA2（R）离子通道电流幅值、失敏常数等多项指标的作用,考察化合物对离子通道开放程度,电流的衰减快慢的影响,明确化合物是否具有促激动活性及正性调节能力。5.LCX001对神经元钙内流的调节作用:利用钙成像检测LCX001稳定GluA2亚基神经元膜表面的定位对神经元钙内流产生的效应;研究结果:1.LCX001抗呼吸抑制具有广谱性LCX001有效改善阿片、丙泊酚和戊巴比妥所致的呼吸抑制:静脉给予芬太尼（120μg/kg）和TH-030418（20μg/kg）均导致严重的呼吸抑制,呼吸频率（BPM）下降70-80%,通气量（MV）下降50%;腹腔给予戊巴比妥（80mg/kg）使BPM与MV均下降约40%,静脉给予丙泊酚（30mg/kg）后,BPM下降60%,通气量下降约40%,引起中等程度的呼吸抑制。LCX001（10mg/kg）预防和急救给药均可改善上述四种药物所致的呼吸抑制,使大鼠的呼吸参数BPM与MV明显上升。LCX001能够快速恢复和稳定阿片和丙泊酚致呼吸抑制大鼠的呼吸功能,使呼吸频率和通气量恢复到基础水平,完全翻转阿片和丙泊酚所致的大鼠呼吸抑制;LCX001同样提升戊巴比妥致呼吸抑制大鼠的呼吸参数,使BPM和MV值逐渐上升约20-30%,部分对抗戊巴比妥所致的大鼠呼吸抑制。2.LCX001脑靶向前药抗呼吸抑制的药效筛选和评价结果2.1LCX001脑靶向前药XD-8-17C有效对抗阿片致小鼠急性死亡利用急性毒性实验,对合成的系列LCX001前药化合物进行筛选,最终结果显示静脉给予LCX001脑靶向前药化合物XD-8-17C（1、3、10mg/kg）可以有效对抗强阿片激动剂TH-030418所致的小鼠急性死亡,使TH-030418致死的量效曲线右移,LD₅₀值提高到单药的4.7倍。2.2XD-8-17C有效改善阿片致呼吸抑制大鼠的血气参数动脉血气参数的检测结果表明静脉给予TH-030418（20μg/kg）诱导大鼠产生严重呼吸抑制,使动脉血氧分压（pO₂）迅速下降,由约90mmHg降至38mmHg,动脉血氧饱合度（sO₂）迅速下降,由94%降至32%。与TH-030418处理组相比,静脉给予LCX001（10mg/kg）或XD-8-17C（3mg/kg）均能够快速逆转动脉血氧分压,氧饱和度的下降,改善了呼吸抑制状态,且在60min检测的时间点上,XD-8-17C对抑制的pO₂和sO₂改善效果强于LCX001。2.3XD-8-17C有效改善阿片致呼吸抑制大鼠的肺功能参数肺功能参数的检测结果显示静脉给予TH-030418（20μg/kg）诱导大鼠产生严重呼吸抑制,呼吸频率降低至基础值的30%左右,每分钟通气量降至基础值的50%左右。与阿片类药物TH-030418处理组相比,10min后静脉给予XD-8-17C（3mg/kg）进行对抗治疗,结果发现XD-8-17C可以快速有效的翻转阿片所致的呼吸参数的下降,并逐渐恢复和稳定呼吸参数至基线水平,且XD-8-17C（3mg/kg）与LCX001（10mg/kg）对呼吸参数的改善效果基本一致。3.LCX001增加转运调控蛋白stargazin的表达,促进AMPA-GluA2（R）的膜定位和分布Westernblot结果提示,LCX001急性处理可以有效提高AMPA受体转运调控蛋白stargazin的表达。免疫荧光法和活细胞成像结果表明,LCX001促进包含GluA2亚基的AMPA受体的神经元膜定位。LCX001在给药后1min显著增强SEP-GluA2（R）的荧光强度,增强效果在检测结束前的7min内仍持续存在,提示LCX001诱导AMPA-GluA2（R）在神经细胞膜表面受体数量的上调与LCX001对AMPA受体正向调节的机制密切相关。4.LCX001对AMPA离子通道动力学特性和细胞兴奋性的影响结果:LCX001通过抑制受体失敏,增大电流幅值,提高细胞兴奋性发挥正向调节作用:LCX001能够使谷氨酸激活AMPA内向电流的量效曲线明显左移,EC₅₀值由3.43mM降至2.76mM,E_max值由902（pA）增至1142（pA）,提示LCX001可显著增强谷氨酸对AMPA受体的亲和力和敏感性;LCX001可使3.5和10mM谷氨酸激活受体的电流分别由432±27增至711±20和752±35增至1120±60（pA）,有效增强AMPA受体内向电流幅值;LCX001显著增加平台期电流（steady-state）/幅值（peak）比值,表明LCX001有效抑制受体失敏,减缓电流衰减,实现电流幅值增强和正向调节效应。5.LCX001限制延髓神经元Ca²⁺内流,缓解钙超载效应生理状态下,GluA2亚基经过特定位点编辑表现出对Ca²⁺的选择性过滤,限制神经元Ca²⁺内流。钙成像结果表明阿片类药物（芬太尼和TH-030418）均可使延髓原代神经元内Ca²⁺浓度迅速上升,并在检测结束前的7-8min内维持神经元内高Ca²⁺水平,引发的钙超载效应,LCX001使原本阿片处理后神经元内的高Ca²⁺浓度部分下降,表明LCX001的加入快速上调神经元表面具有Ca²⁺不通透特性的GluA2R亚基的数量,有效的限制Ca²⁺内流,缓解钙超载,起到神经保护的作用,参与呼吸抑制的调节。结论:1.LCX001抗呼吸抑制具有广谱性,对多种不同靶点药物所引起的呼吸抑制均具有改善作用。2.LCX001脑靶向前药化合物XD-8-17C以较低剂量达到与LCX001相当或部分优于LCX001的治疗效果,表明XD-8-17C具有更强的抗阿片致呼吸抑制的效应。