FDA与ISO食品微生物检验方法小学教育

1/1FDA与ISO食品微生物检验方法-小学教育

食品微生物检验方法（FDA与ISO对比）

内容提要：

z菌落总数检测

z大肠菌群及大肠杆菌检测

z金黄色葡萄球菌检测

z沙门氏菌检测

z单核细胞增生李斯特氏菌检测

菌落总数测定——菌落总数的概念

z菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm）内，所含能于某种固2

体培育基上，在肯定条件下培育后所生成的菌落的总数。

菌落总数测定——卫生学意义

z判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。

z准时反映食品加工过程是否符合卫生要求，为被检食品卫生学评价供应依据。

z通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染的可能性越大，菌落总数的多少在肯定程度上标志着食品卫生质量的优劣。

FDABAM菌落总数测定流程

检样xg/mL+9xml

适当十倍稀释样品

选择2~3个连续相宜稀释度

各取1mL分别加入灭菌平皿内

每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA）

35℃482h

FDABAM菌落计数方法

25~250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下：N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*d

z全部平板的菌落数都不足25CFU，报告EAPC/ml（g）为＜25*1/d。EAPC：estimatedaerobicplatecount2z全部平板的菌落数都超过250CFU，但不足100/cm，报告EAPC/ml（g）为最接近250CFU的平板菌落数的估量值，乘以相应的稀释度。

22z全部平板的菌落数都超过100/cm，计算平板的面积（直径为90mm的平板面积为65cm），估

计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml（g）为＞65*100*1/d。

z无法计数的平板报告LA（LaboratoryAccident）。

z最终结果保留前两位有效数字。根据4舍6入，5是奇进偶不进。z选择

ISO4833-2023菌落总数测定流程

检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）

适当十倍稀释样品

选择2~3个连续相宜稀释度

各取1mL分别加入灭菌平皿内

每皿内加入适量（12~15mL）

平板计数琼脂（PCA），

301℃，723h

ISO4833-2023菌落计数方法

2个稀释度不超过300CFU的平板，且一个平板至少含15CFU进行计数，计算公式如

下：N=∑C/（n1+0.1*n2）*d

z全部平板的菌落数都不足15CFU，计算2平板菌落的算术平均值m，液体样品：NE=m固体样

品：NE=md-1

z无菌生长：液体样品：lessthan1;固体样品：lessthan1d-1

z最终结果保留前两位有效数字。z选择连续

菌落总数测定几点说明

30/35℃有氧条件下培育，因而并不是样品中实际的总活菌数，一些特别养分

要求的细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌，均难以反映出来。

z鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在平板上

消失的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因而平板上所得菌落的数字不应报告活

菌数，而应以单位重量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）报告。z由于检样中采纳

菌落总数测定几点要求

15min，主要为防止细菌增殖和

产生片状菌落。样液与琼脂应充分混合，避开将混合物溅到平皿壁和皿盖上。皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，然后倒置培育，可避开菌落扩散生长。

z检样过程中应用稀释剂做空白对比，用以判定稀释液、培育基、平皿或吸管可能存在的污染。

同时，检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时间相当，以

了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。

z检样稀释液有时带有食品颗粒，为避开与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与平板计数琼

脂混合的平皿，不经培育，于4℃放置，以便在计数检样时用作对比。z每个样品从开头稀释到倾注最终一个平皿所用的时间不得超过

大肠菌群的定义

z大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

z大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是依据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全全都。依据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。

大肠杆菌的定义

z大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。

z大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为++--或-+--的细菌。

z与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。

卫生学意义

z大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。

z食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的凹凸，表明白粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。

z大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的消失预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。

大肠杆菌的生物学特性

基本形态：

此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8μm*1.0-3.0μm，多单独存在或成双，但不呈

长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对一般碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。

培育特性：

z大肠杆菌合成代谢力量强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的一般培育基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46℃。

大肠菌群及大肠杆菌测定

——MPN法检验流程（FDABAM）

检样稀释液

适当十倍稀释样品

选择3

每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），

每管接种1mL

44.50.5℃（水浴培育）

242h~482h

查MPN表报告结果产气管接种EMB平板（35℃、18~24h）

（大肠菌群）从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接

种LST复检产气

查MPN表报告结果（大肠杆菌）

大肠菌群测定——MPN法检验几点说明

MPN检索表：

MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。z初发酵和证明试验：

1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证明试验所用培育基不同，但都是为了证明培育物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。

2）初发酵阳性管，不能确定就是大肠菌群细菌，经过证明试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证明试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证明试验是必需的。

z产气量与倒管：

在乳糖发酵试验工作中，常常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。试验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部布满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。假如对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。

大肠杆菌测定——EMB选择性分别鉴别

EMB平板典型大肠杆菌菌落特征：

中心黑色或紫红色，有或无绿色金属光泽z

大肠杆菌测定——EMB选择性分别鉴别

zEMB是一种弱选择性培育基，一些球菌也可在该培育基上生长；

z高压灭菌可使得美蓝还原从而使培育基的颜色呈不均一橘黄色，轻轻摇动培育基可以恢复原有的正常紫色，倾注平板前应先摇匀；

z大肠杆菌在该培育基上并不肯定总是呈现绿色的金属光泽；

z该培育基受可见光易使其中的成分氧化，储存及培育细菌时都应在避光条件。

大肠杆菌测定——革兰氏染色

基本步骤：

z将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染

z滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；1min，水洗；

z滴加95%乙醇脱色约15～30s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；

z滴加番红复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。

z结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

大肠杆菌测定——生化鉴定

（表略）

金黄色葡萄球菌——概述

依据《伯杰氏鉴定细菌学手册》，按葡萄球菌的生理化学组成，将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)，其中金葡多为致病性菌，表葡间或致病。

z金黄色葡萄球菌是人类化脓性感染中最常见的病原菌。可引起局部化脓性感染，如疖、痈、皮下脓肿、外科切口及烧伤创面的感染；也可引起肺炎、伪膜性肠炎、肾盂肾炎、心包炎等多系统的化脓性感染；还可引起败血症、脓毒症等全身性感染。葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶。z

金黄色葡萄球菌——生物学特性

金黄色葡萄球菌呈球形，直径0.8μm左右，排列成葡萄串状，无芽孢，无荚膜。

金黄色葡萄球菌——生长特性

z金黄色葡萄球菌在肉汤中呈浑浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈浑浊生长。

金黄色葡萄球菌检验——方法适用性

zMPN法：适用于检测带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的含少量金黄色葡萄球菌的食品。

z直接平板计数法：适用于检查金黄色葡萄球菌数不小于10/g（ml）的食品。

z增菌培育法：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。

金黄色葡萄球菌检验——直接平板计数法

（FDABAMISO）

检样（稀释液）

选择2~3个连续相宜稀释度

吸取1ml菌液根据0.3mL、0.4mL分别涂布于

3块90mmBaird-Parker平板上（做平行试验）35℃，45~48h

报告

FDABAM金黄色葡萄球菌检验——MPN法

检样（稀释液）

选择3个相宜的连续稀释度的样品稀释液，

每个稀释度接种三管10%NaClTSB肉汤，

1mL

℃，482h

从生长的管中接种1环划线于Baird-Parker平板上

℃，48h

报告

FDABAM金黄色葡萄球菌确证试验

1.凝固酶试验

z方法：从平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落，移种到TSB/BHI肉汤中，置35℃培育18-24h。取肉汤培育物0.3mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆充分混合，置35℃培育，定时观看是否有凝块形成，至少观看6h。试验中需同时做已知阳性和阴性对比。

z结果判定：以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流淌为阳性。部分凝固（2+和3+）的必需进行生化鉴定加以证明。

FDABAM金黄色葡萄球菌确证试验

2.革兰氏染色

z对全部的可疑培育物都要进行革兰氏染色。

3.生化鉴定

z过氧化氢酶试验

z葡萄糖厌氧利用试验

z甘露醇厌氧利用试验

z金葡溶菌酶敏感性试验

z耐热核酸酶试验（帮助）

ISO金黄色葡萄球菌检验——MPN法

检样（xg+9xmL稀释液）

适当十倍稀释样品选择3

每个稀释度接种三管，

37℃，24~48h

接种1环培育物于平板上

37℃，48h

报告

沙门氏菌属简介

z1880年E.Berth首先发觉伤寒沙门氏菌，1885年Salmon与Smith又分别出猪霍乱沙门氏菌，以后取Salmon氏之名为本菌属之名。

z沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构简单，现已发觉2000多个血清型，我国已发觉血清型近200个。

沙门氏菌属——生物学特性

形态特征：

革兰氏阴性，大小为1~30.4~0.9μm的两端钝圆的短杆菌，无芽孢，一般无荚膜，除鸡沙门氏菌和雏沙门氏菌以外，都有周身鞭毛，运动力强。

培育特性：

℃都可生长，最适生长温度为37℃，最适pH为6.8~7.8。

z养分琼脂平板上：35~37℃培育18~24h，其菌落大小一般为2~3mm，光滑、潮湿、无色、半透亮     、边缘整齐。

z血平板上：中等大小的灰白色菌落。z沙门氏菌需氧或兼性厌氧，10-42

沙门氏菌属的抗原

z菌体抗原（O抗原）

z表面抗原（K抗原）：Vi抗原和M抗原

z鞭毛抗原（H抗原）

z纤毛抗原

FDABAM沙门氏菌检验流程

前增菌

选择性增菌

42℃、24h

℃、24h（水浴培育）

含菌量低

分别培育划线接种选择性培育基（℃、24~48h（BS）

生化鉴定2个可疑菌（包括典型和非典型各2个）

接种TSI三糖铁、LIA赖氨酸铁高层斜面（LIA高层深4cm）

（松盖以保持有氧条件防止产生过多H2S）

℃、242h

弃去卫矛醇、氰化钾、丙二酸钠、吲哚试验

阳性阴性

血清学——沙门氏菌的分类

报告结果

ISO6579沙门氏菌检验流程

前增菌

25g样+225mLBPW

选择性增菌

371℃、243h

分别培育37℃、24~48h（BS）

每个平板挑取至少5个可疑菌进行纯培育和确认试验

37℃、243h

生化鉴定TSI、尿素酶、赖氨酸脱羧酶、β-牛乳糖、V-P、吲哚试验

血清学——沙门氏菌的分类

报告结果

沙门氏菌检验选择性分别培育

XLD琼脂：

FDABAM——典型菌落：粉色菌落，带或不带黑色中心。很多沙门氏菌培育物可呈现大的具光泽的黑色中心或几乎为全部黑色的菌落。

——非典型菌落：黄色带或不带黑色中心。ISO——中心黑色、四周由于指示剂颜色的转变而消失红色的稍微透亮     带。

菌名菌落形态

鼠伤寒沙门氏菌红色，有黑心

伤寒沙门氏菌红色，有黑心

弗氏志贺氏菌红色

大肠埃希氏菌黄色，有胆盐沉淀环

-粪链球菌

沙门氏菌检验选择性分别培育

BS琼脂：

FDABAM——典型菌落：产硫化氢菌落黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落四周的培育基通常开头呈褐色，但伴随培育时间的延长而变为黑色，并有晕环效应；

——非典型菌落：有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色菌落，四周培育基不变色。

沙门氏菌检验选择性分别培育

HE琼脂：

FDABAM——典型菌落：兰绿色至兰色，多数菌株产硫化氢，菌落带或不带黑色,中心或几乎全黑色。

——非典型菌落：乳糖阳性的菌株为黄色中心黑色或全黑色。

沙门氏菌检验生化鉴定

TSI：

典型反应：斜面产碱（K）：红色；底部产酸（A）：黄色；产H2S：黑色（少数不产）

沙门氏菌检验——几点留意

z冷冻样品解冻需在45℃以下，有自动调温器自控的水浴锅内不断搅拌进行15min或在2-8℃，18小时内软化。

–为保证检验的精确     性，必需在选择性培育基上挑取足够数量的菌落进行生化和血清学鉴定。z进行生化反应时，应以纯培育物进行试验，如消失血清学阳性，而生化反应特征不符合时，应对接种物进行纯化，用纯化后的培育物重新进行生化试验。

–测试中应同时接种阳性对比菌株。

李斯特菌属简介

9版中，李斯特菌属有7个种：单核细胞增生李斯特氏菌（L.

monocytogenes）、英诺克李斯特氏菌（L.innocua）、西尔李斯特氏菌（L.seeligeri）、威尔斯李斯特氏菌（L.welshimeri）、绵羊李斯特氏菌（L.ivanovvi）、格氏李斯特氏菌（L.grayi）、默氏李斯特氏菌（L.murrayi）。

z单核细胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌病的致病菌，可引起动物的感染，也可引起人的感染。

z《伯杰氏鉴定细菌学手册》第

单核细胞增生李斯特氏菌——生物学特性

形态特征：

革兰氏阳性短杆菌，大小为0.4~0.50.5~2μm，两端钝圆，常两两相串成弯曲及V形，间或有球状、双球状、短链状，但很少有长链状，兼性厌氧、无芽孢，一般不形成荚膜。该菌有4根周毛和1根端毛，周毛易脱落。20℃培育后可见到许多鞭毛。

培育特性：

生长温度为2~42℃（冷藏不能阻挡该菌的生长），最适生长温度为35~37℃。20~25℃培育有动力，37℃培育动力消逝；在显微镜下观看该菌新奇的室温肉汤培育物可见翻筋斗运动。z在pH3.8~4.4仍能生长，在pH中性至弱碱性（9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在6.5%NaCl肉汤中也能良好生长。

z血平板上：菌落通常不大呈灰白色，刺种血平板可产生窄小的β溶血环。z

FDABAM单核细胞增生李斯特氏菌检验流程25g

增菌EB增菌液基础225mL

30℃4h

℃44h

选择性分别培育接种

和PALCAM

35℃24-48h

生化鉴定

过氧化氢酶试验

革兰氏染色溶血试验

ISO单核细胞增生李斯特氏菌检验流程

测试样品（xg或xmL）+9xmL一次增菌培育基（HalfFraser肉汤）30℃培育242h

1mL培育液加入Oxford琼脂

琼脂

（30℃、35℃或

37℃培育24-48h

划线接种和挑取可疑菌接种TSAYE培育基

过氧化氢酶试验

革兰氏染色

单核细胞增生李斯特菌的确证：

溶血试验

碳源利用试验

CAMP（协同溶血）试验

单核细胞增生李斯特氏菌——溶血试验

制备5~7%羊血琼脂平板。

z挑取TSAYE平板上的典型菌落刺种血平板，刺种时避开接触到平板底部和使琼脂裂开，同时接种阳性（单核细胞增生李斯特氏菌）和阴性（英诺克李斯特氏菌）对比。

z单增呈现狭窄、清楚、光明的β-溶血；

z西尔李氏菌消失弱的溶血现象；

z绵羊李氏菌通常呈宽的、轮廓清楚的β-溶血；

z英诺克李氏菌不产生溶血现象。

单核细胞增生李斯特氏菌——协同溶血试验（CAMP）

z方法：在羊血琼脂平板上平行接种β-溶血金黄色葡萄球菌（S.aureus）和马红球菌(R.equi),在它们中间垂直划线接种可疑菌，与两线相近但不相交，在30℃培育24h-48h,检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。

z结果：靠近金黄色葡萄球菌接种点的单增李斯特氏菌的溶血增加，西尔李斯特氏菌的溶血也增加，绵羊李斯特氏菌在马红血球四周的溶血增加。

z