第十一章核酸的生物合成

第一节DNA的生物合成第二节RNA的生物合成第十一章核酸的生物合成中心法那么涉及的几个概念复制：是亲代双链DNA按碱基配对原那么，准确构成两个一样核苷酸序列的子代DNA分子的过程。两条DNA链都可作为复制的模板。转录：是以一条DNA链为模板，将DNA链上储存的遗传信息按碱基配对原那么准确转换成互补的mRNA的过程。翻译：是以mRNA为模板，将mRNA上的遗传信息转换成蛋白质的氨基酸序列的过程。中心法那么：遗传信息由DNAmRNAPRO的流动途径。蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA中心法那么：遗传信息由DNAmRNAPRO的流动途径。补充和完善之处：A：RNA作为遗传物质能自我复制，并作为mRNA指点PRO的合成。B：RNA能以逆转录的方式将遗传信息传送给DNA分子。第一节DNA的生物合成一、半保管复制1、半保管复制的概念

DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原那么合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保管复制。2、DNA的半保管复制实验根据

1958年Meselson&stahl用同位素示踪标志加密度梯度离心技术实验,证明了DNA是采取半保管的方式进展复制.[15N]DNA[14N-15N]DNA[14N]DNA[14N-15N]DNAMeselson-stahl实验〔a〕密度梯度离心的DNA带〔b〕对应于左侧DNA带的解释3、生物学意义坚持了物种的相对稳定性.这和DNA的遗传功能相吻合，但这种稳定性是相对的，由于DNA在代谢上不是完全惰性物质：〔1〕一定条件下，DNA会损伤，需求修复；〔2〕在复制和转录中，DNA会有耗费，需求更新；〔3〕在发育和分化中，DNA特定序列能够修饰、删除、扩增、重排。4、遗传物质的条件：能储存本人的遗传信息；能准确将遗传信息传给后代；必需有才干在不损失亲代主要信息的前提下，做一些小的变化，即变异。二、与DNA复制有关的酶和蛋白质〔原核生物〕解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物酶和引发体DNA聚合酶ISSB3´3´5´3´5´5´RNA引物〔一〕DNA聚合酶1、DNA聚合酶ⅠpolⅠ(1)具5′3′聚合酶活性将脱氧核糖核苷三磷酸dNTP逐个添加到具有3′—OH末端的多核苷酸链上构成3，5—磷酸二酯键。特点：A：底物为dNTP；B：DNA模板(3′5′)；C：引物：RNA引物〔带3′—羟基〕；D：方向5′3′；F：产物DNA的性质与模板一样。DNA聚合酶催化的链延伸反响5´RNA引物子链3´3´5´5´3´3´5´5´3´3´5´模板链

(2)具有3′5′端核酸外切酶的活性有校正功能，能在3′—OH端将DNA链水解。以保证DNA复制的真实性。DNA聚合酶的3´-5´外切酶水解位点3´3´5´5´错配碱基3´-5´核酸外切酶水解位点(3)具有5′3′端核酸外切酶的活性由5′端水解DNA链，主要是切去一小段DNA，包括RNA引物和损伤DNA部分。polⅠ主要功能：用于修复DNA双螺旋区中的单链区，这些单链区是在DNA复制时或DNA受损伤后留下的。活性高。DNA聚合酶5´-3´外切酶活力

5´-3´核酸外切酶水解位点单链缺口5´2、DNA聚合酶ⅡpolⅡ具有3′5′端核酸外切酶的活性,主要担任DNA的修复，在一定程度上参与DNA复制。活性低。功能不非常清楚，是一种修复酶。3、DNA聚合酶ⅢpolⅢ是使DNA链延伸的主要聚合酶，目前知全酶是由7种多肽构成的复合物，含有10种共22个亚基组分〔α2ε2θ2ζ2г2δ2δ2′2χ2ψ2β2〕和Zn原子。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的构造和功能

延伸因子DNA聚合酶Ⅲ两个亚基夹住DNADNA聚合酶Ⅲ异二聚体中心酶校正引物的结合和识别促使中心酶二聚化〔1〕α亚基：具5′3′端聚合酶活性〔需模板和引物〕；〔2〕ε亚基具3′5′端核酸外切酶的活性。校正作用，以提高保真性；〔3〕α、ε、θ亚基相连构成中心酶polⅢ，θ亚基起组建作用；〔4〕中心酶+ζ亚基后成为二聚体，称为polⅢ′；〔5〕polⅢ′与γ、δ亚基结合，构成polⅢ′，γ、δ亚基可加强酶与模板的结合；〔6〕polⅢ′′与β亚基结合构成全酶，β亚基犹如夹子，夹住DNA向前滑动，不脱离，提高继续合成才干。大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ分子量每个细胞的分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用转化率DNA聚合酶Ⅰ109，000400+++1120，000100++-0.05400，00010-20++-50比较工程DNA聚合酶切除引物修复修复复制功能1999年发现聚合酶和，它们涉及DNA的错误倾向修复〔erroounerepair〕polⅠ不是DNA复制酶，理由：A、该酶合成DNA速度太慢，只是细胞内DNA复制速度的1%；B、继续合成才干较低，而细胞内DNA复制不会频繁中止；C、许多基因突变都会影响DNA复制，但都与polⅠ无关。4、DNA聚合酶ⅣⅤpolⅣpolⅤ1999年发现，涉及DNA的错误损伤修复。能在DNA许多损伤部位继续复制，而正常的polⅠ、polⅡ、polⅢ在此部位不能构成正确碱基配对而停顿复制，在跨越损伤部位时呵斥错误倾向的复制。真核生物的DNA聚合酶：有六种α：在DNA复制中起主要作用，与随后链合成有关；δ：在DNA复制中起主要作用，与领头〔前导〕链合成有关，具有3′5′端核酸外切酶的活性；β：修复功能；γ：位于线粒体中，与线粒体DNA复制有关；ε：具3′5′端核酸外切酶的活性；附属蛋白：具3′5′端核酸外切酶的活性。〔二〕解螺旋酶〔helicase〕使DNA双螺旋的两条链分开。条件：ATP提供能量，有单链DNA存在。随后链：解旋酶结合于它的模板上，挪动方向是5′3′；领头链：另一种解旋酶叫rep蛋白，挪动方向是3′5′。〔三〕拓扑异构酶〔DNA松弛酶〕〔topoisomerase〕涉及超螺旋的松弛，复制后又涉及到它们的再次构成。正超螺旋〔左〕：双螺旋DNA处于拧紧形状时构成的超螺旋，使DNA解开双螺旋困难：负超螺旋〔右〕：双螺旋DNA处于拧松形状时构成的超螺旋。拓扑异构酶对DNA的超螺旋进展准确调理，从而在DNA重组修复和DNA其它转变中起作用。分为两类：1、拓扑异构酶Ⅰ：可瞬时翻开双螺旋的一条链，然后再衔接。不需能量，同转录相关。2、拓扑异构酶Ⅱ；使DNA双链同时断裂，然后再衔接。需能量ATP，同复制相关。拓扑异构酶Ⅰ可除去负超螺旋，拓扑异构酶Ⅱ可引入负超螺旋，消除复制前产生的正超螺旋，协同作用控制DNA拓扑构造，有利于DNA解开双螺旋。〔四〕引发酶〔引物合成酶〕引物的合成由引发酶催化完成，这些酶在模板单链DNA上识别特殊序列，合成RNA引物。它本身没有活性，需求与“引发前体〞结合在一同，构成“引发体〞后才有活性。复制早期易发生碱基参入错误，用RNA较好，然后经过polⅠ的5′3′端核酸外切酶的活性切去，代之以dNMP，可消除最初阶段的错误。〔五〕其它蛋白因子1、单链结合蛋白〔single-strandbindingprotein，SSB〕结合在单链DNA分子上，功能是稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和维护单链不被核酸酶降解。2、引发前体由六种蛋白质组成〔DnaB、DnaC、Dnan、Dnan′、Dnan′′、Dnai〕，与RNA引物合成酶结合，组装成引发体〔primosome〕。功能：识别合成起始位点功能，可沿模板链方向挪动，挪动到一定位置即可引发RNA引物合成，从而合成领头链和冈崎片段。引发体成分〔六〕DNA衔接酶催化子代双链DNA中的切口处的相邻3′—OH和5′—磷酰基之间构成磷酸二酯键。但不能将两条游离的DNA单链衔接起来。同时该酶要求含有3′—OH和5′—磷酰基的DNA片段能以氢键与互补链结合。DNA—3′—OH＋P—5′—DNA＋ATP〔NAD+〕DNA—3′—O—P—5′—DNA＋AMP＋PPi〔NMN〕E,coli衔接酶催化下的衔接机制衔接酶衔接切口Mg2+衔接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板链模板链三、DNA的复制过程〔原核生物〕DNA的合成是以四种脱氧核苷三磷酸即dATP、dGTP、dCTP、dTTP为前体，在DNA聚合酶的催化下，向DNA的3′—OH端添加脱氧核苷酸，在DNA的3′—OH与添加的脱氧核苷酸的5′—磷酰基间构成3，5—磷酸二酯键，反响中脱去一个焦磷酸基团。合成方向：5′3′添加到链上的每个核苷三磷酸是按照模板链的顺序由碱基互补配对原那么选择的。反响的通式可写为：〔NMP〕n—3′—OH＋dNTP〔NMP〕n＋1—3′—OH＋PPiDNA聚合酶催化的链延伸反响5´RNA引物子链3´3´5´5´3´3´5´5´3´3´5´模板链〔一〕双链的解开〔起始〕1、复制原点(ori或o)DNA分子复制的特定位置，是一段指示复制起始的序列，多富含A、T的区段。E.coli的复制原点由245个碱基对组成，关键是成串陈列的3个13bp序列〔GATCTNTTNTTTT〕和间隔陈列的4个9bp序列〔TTATCCACA，是DnaA蛋白结合位点〕大肠杆菌复制起点成串陈列的反复序列

GATCTNTTNTTT成串陈列的三个13bp序列共有序列共有序列TTATCCACADnaA蛋白结合位点四个9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的构造模型E.coli的oriC构造方式aOriC内富含A-T序列和4个9碱基对反复序列的分布b在oriC处复制起始方式原核生物：只需一个复制原点。第二次复制可在第一次复制完成之前开场复制。真核生物；可在DNA链上的多个不同位点同时起始复制。所以真核生物的DNA复制速度比原核生物快些。真核生物DNA的多起点复制2、复制叉〔replicationforks〕复制叉：复制中的DNA分子，未复制的部分是亲代双螺旋，而复制好的部分是分开的，由两个子代双螺旋组成，复制正在进展的部分叫做复制叉。DnaA蛋白是关键成分，大约20个与复制原点的4个9bp序列结合，使DNA延续不断变性，启动解链过程复制子：基因组能独立进展复制的单位。每个复制子含有控制复制起始的起点，能够还有中止复制的终点。果蝇胚胎中复制DNA的电子显微镜照片从图中可以看到大量的复制叉，左下角为照片的表示图方向：复制叉从起始点出发，沿DNA挪动，挪动方向与前导链的延伸方向一样。复制能够是单向的，也能够是双向的，两个方向的复制速度不一定一样。大多数是双向的。眼状构造：线状DNA分子上的正在复制的部分构成；θ构造：环状DNA分子上的正在复制的部分构成。DNA的双向和单向复制环状DNA复制时所构成的Q构造起始点复制叉的推进复制叉起始点起始点起始点复制叉复制叉未复制DNA单向复制双向复制两种复制方式〔a〕单向复制方式〔b〕大肠杆菌染色体DNA双向复制方式单向复制i双向复制察看到的放射自显影图象18%质粒ColE1的单向复制表示图单向复制最早研讨DNA复制起点和方向的是J.Cairns〔1963年〕。θ型DNAReplication〔二〕RNA引物的合成引发酶与引发前体结合构成引发体，引发体在复制叉上挪动，识别合成的起始点，引发RNA引物的合成，该过程需ATP提供能量。方向：以DNA为模板，5′3′长度：几个至10个核苷酸，5′端含3个磷酸残基，3′端为游离羟基。为什么需求RNA引物、而且最后要切除？1、DNA聚合酶有校正功能，每引入一个核苷酸都要复查一次，无误后方继续下去，它不能从无到有合成新的链，由于在未核实前一个核苷酸处于正确配对形状时是不会进展聚合反响的；2、RNA引物是重新开场所成的，错配的能够性大，在完成引物功能后即将它删除，而代之以高保真的DNA链。〔三〕DNA链的延伸在一个复制叉内两条链的复制方向、合成方式、复制速度是不同的。前导链〔领头链〕〔leadingstrand)：以一条链〔3′5′〕为模板时，子代链的合成方向是5′3′，合成是延续的，合成速度较快。随后链〔后随链〕〔laggingstrand〕；以另一条亲代链〔5′3′〕为模板时，子代链的合成方向不能按照35′方向进展，由于迄今没有发现这样的DNA聚合酶，因此只能合成方向为5′3′方向的许多DNA小片段〔约1000--------2000dp，7-----10S〕，为1968年日本人冈崎等人发现，叫冈崎片段，然后在DNA衔接酶催化下，衔接起来构成一条子代链。合成是不延续的，合成速度较慢。当一段新的冈崎片段合成后，polⅠ行使5′3′核酸外切酶活性切除引物，再合成一段DNA作为交换，缺口由DAN衔接酶封口。原核细胞DNA的半不延续复制复制过程

复制叉的挪动方向解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物体DNA聚合酶ISSB3´3´5´前导链随后链3´5´复制的起始DNA链的延伸DNA链终止5´RNA引物3´3´大肠杆菌复制体构造表示图1

机制：后随链的模板在全酶上绕转180。构成一个小环，使冈崎片段合成方向与前导链合成方向一致，与复制叉挪动方向一致，最后构成大环再释放，当然，每合成一个冈崎片段都需起始一次，由引物酶合成一个引物。聚合酶III中心酶大肠杆菌复制体构造表示图聚合酶I聚合酶III中心酶滞后链前导链解螺旋酶引物合成酶RNA引物引发体拓扑异构酶II-夹子-聚体-夹子-复合物RNA引物单链结合蛋白〔SSB〕复制叉处前导链和随后链同时合成的任务模型聚合酶III全酶引物聚合酶III全酶引物引物体引物体解旋酶解旋酶参与DNA复制叉挪动的蛋白质前导链和滞后链的合成

半不延续复制：在DNA复制过程中，一条链的合成是延续的，另一条链的合成是不延续的。polⅢ全酶同时担任前导链和后随链的合成。〔四〕终止有终止子位点〔22bp〕，有一种蛋白质称为终止利用基质与终止位点结合，抑制解螺旋酶的活性，阻止复制子经过终止位点。大肠杆菌染色体复制的终止oric复制叉2复制叉1终止复制叉2终止复制叉1复制叉1复制叉2完成复制DNA拓扑异构酶连锁染色体1、前导链延续复制终了后：〔1〕polⅠ：切除引物，表现5′3′核酸外切酶活性；〔2〕polⅠ：催化合成一段DNA填补上，表现5′3′聚合酶活性；〔3〕在DNA衔接酶作用下，衔接上述两种DNA片段。2、后随链当新构成的冈崎片段延伸至一定长度时：〔1〕polⅠ：在DNA片段与引物RNA之间切断，表现5′3′核酸外切酶活性；〔2〕polⅠ：催化合成一段DNA填补上，表现5′3′聚合酶活性；〔3〕衔接修复：在DNA衔接酶作用下，衔接上述两种DNA片段。polⅡ：修复错配碱基。〔五〕复制后DNA再加工两组反响：1、起修饰作用的甲基化酶催化碱基甲基化，以防止DNA被限制性内切酶降解；2、由多种不同的DNA修复机制组成。四、真核细胞DNA复制不非常清楚，与原核生物DNA复制比较：〔一〕一致：1、根本机制类似。如半保管复制、半不延续复制。2、所需酶类似。〔二〕区别真核生物原核生物复制起始点多个一个复制方向双向单向复制速度较快较慢起始点能否延续复制不是催化DNA链延伸的酶两种酶〔polα、δ〕一种酶〔polⅢ〕引物酶的结合情况与DNA聚合酶与解旋酶DNA复制具有高度的真实性，以保证遗传信息一代一代传送，物种不会改动。主要有三个要素：1、具有3′5′核酸外切酶活性的polⅠ、polⅢ切除参入的错误碱基；2、复制体的组成。各种酶、蛋白质在性质、活性上相互依赖，构成网络，保证反响过程极高准确性；3、运用RNA引物而不是DNA引物，可消除初期容易发生的错误〔错配碱基〕。DNA聚合酶的校正功能聚合酶错配硷基复制方向正确核苷酸5´5´5´3´3´3´切除错配核苷酸五、DNA的损伤修复〔一〕突变基因组DNA的碱基顺序发生忽然而永久性的改动。1、点突变：指一个或几个碱基对被置换。有两种方式：转换：一个嘌呤碱基或一个嘧啶碱基转换为另一个嘌呤或嘧啶碱基。如TA被CG交换。颠换：嘌呤碱基变成嘧啶碱基或嘧啶碱基变成嘌呤碱基。如TA被AT交换。2、构造畸变DNA的大段碱基发生改动。包括：插入、缺失、倒位、易位。DNA突变的类型-T-C-T-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-C-G-A-C-A-T-G-C-转换野生型基因-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C--T-C-T-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-A-G-A-C-A-T-G-C-颠换碱基对的置换(substitution)移码突变(framesshiftmutation)-T-C-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-插入-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失AT呵斥DNA损伤的缘由能够是生物要素、物理要素或是化学要素；能够来自细胞内部，也能够来自细胞外部；遭到破坏的能够是DNA的碱基、糖基或是磷酸二酯键。物理诱变剂：如紫外线、X射线等。生物诱变剂：如噬菌体、抗菌素等。化学诱变剂：直接作用于DNA模板的诱变剂，如亚硝酸、烷化剂等。碱基类似物：如5—溴尿嘧啶。移码诱变剂：如普鲁黄。〔二〕DNA的损伤修复系统1、直接修复〔directrepair〕对由紫外线引起的胸腺嘧啶二聚体的光复活作用是一种高度专注的直接修复方式，只作用于由紫外线引起的胸腺嘧啶二聚体。这种构造不能构成碱基配对，使DNA链丧失了模板的功能。用强的可见光照射受损伤的细胞，可见光将光裂合酶激活，此酶与二聚体结合并将其恢复成两个单独的嘧啶碱。胸腺嘧啶的构成表示图DNA紫外线损伤的光裂合酶修复1、构成嘧啶二聚体2、光复合酶结合于损伤部位3、酶被可见光激活4、修复后酶被释放2、切除修复〔excisionrepair〕是在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除掉，并以完好的那一条链为模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢复正常构造的过程。包括两个过程：一是由细胞内特异的酶找到DNA的损伤部位，切除含有损伤构造的核酸链；二是修复合成并衔接。DNA的损伤和切除修复碱基丧失碱基缺陷或错配构造缺陷切开核酸内切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA衔接酶AP核酸内切酶核酸外切酶切开切除修复衔接糖苷酶插入酶碱基取代细胞含有的DNA糖基化酶能使不正确的碱基或发生改动的碱基的糖苷键断裂，切除碱基，产生一个只保管有脱氧核糖磷酸部分的位点。称为AP位点〔无嘌呤或无嘧啶的位点〕。一旦AP位点构成后，即有AP核酸内切酶在AP位点附近将DNA链切开。在AP位点必需切除假设干核苷酸后才干进展修复合成，细胞内没有酶能在AP位点直接将碱基插入，由于DNA合成的前体物质是核苷酸而不是碱基。3、错配修复〔mismatchrepair〕复制过程中，DNA多聚酶将不正确的碱基参入DNA链而构成一些非Watson—Crick配对方式。当DAN多聚酶Ⅰ和Ⅲ的校正功能不能纠正这种错误时，它可以经过错配修复机制来消除。〔4〕错配修复〔mismatchrepair〕错配修复实践上是一种特殊的核苷酸切除修复，它专门用来修复在DNA复制中出现的新合成DNA链上的错配的碱基。但如何防止将DNA链上正确的碱基切除呢？这就需求将oldstrand和newstrand区分开来。原核生物利用甲基化区分oldstrand和newstrand，因此原核细胞中的错配修复也称甲基化指点的错配修复〔methyl-directedmismatchrepair〕。原核细胞DNA的甲基化位点位于5′GATC序列中腺嘌呤碱基的6位N原子上，催化甲基化的酶为Dam甲基化酶〔Dammethylase〕，刚合成的DNA新链上的GATC序列还没有来得及甲基化，而作为模板的oldstrand早已被甲基化了，利用这种差别区分oldstrand和newstrand。一旦发现错配碱基，即将未甲基化的链切除，并以甲基化的链为模板进展修复合成。错配修复是一个非常耗能的过程。错配的碱基间隔GATC序列越远，被切除的核苷酸就越多，重新合成新链所需求耗费的脱氧核苷三磷酸单体就越多。无论耗费多少dNTPs，目的都是为了修复一个错配的碱基，这阐明机体为了维护遗传物质的稳定性可以说不惜一切代价。错配修复机制是建立在DNA出现的甲基化的根底上，在复制过程中，含有所需求甲基化的碱基的亲代链充分甲基化。由于DNA甲基化滞后于DNA的合成，新的子代DNA链在合成的大部分时期里，坚持着非甲基化。错配修复系统具有既能识别非甲基化序列又能识别新合成的子代链中的错配碱基对的才干。被识别的非甲基化序列就作为修复的目的链。修复过程包括切除一段含有错配碱基的非甲基化序列，然后重新合成一段正确的碱基序列来交换被切除的碱基序列。4、重组修复有时在进展DNA修复之前，受损环的DNA链经常还能进展复制。在这种情况下，受损亲代链的复制受损坏碱基的干扰，跨过这段损坏序列后，此时在新的一个起点继续开场复制，此时新合成的子代链的碱基序列就有了一个缺口。这种缺口可以经过重组修复机制纠正。过程：从同源DNA的母链上将相应核苷酸序列片段以致子链缺口处，然后用再合成的序列来补上母链的空缺。在重组修复过程中，DNA链的损伤部位能够被切除，也能够未被切除。DNA的重组修复胸腺嘧啶二聚体复制核酸酶及重组蛋白修复复制DNA聚合酶DNA衔接酶重组5、应急反响〔SOS〕和易错修复SOS反响是细胞DNA遭到损伤或复制遭到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的应急效应。DNA聚合酶Ⅰ具有35核酸外切酶活性而表现出校正功能，它在DNA损伤部位进展复制时，由于新合成链的核苷酸不能和模板链的碱基配对而被切除，再次引入的核苷酸如还不能配对仍将被切除，这样DNA聚合酶就会在原地打转而不前进，或是零落下来使DNA链的合成终止。这时，SOS基因表达的产物都是与DNA修复有关的酶类，使这些酶在细胞内的含量升高，这些基因称为DNA紧急修复基因。SOS反响的机制未诱导的细胞靶基因lexA基因被LexA蛋白质部分阻遏recA基因被LexA蛋白质部分阻遏〔40个不同的位点被阻遏〕LexA(阻遏物)RecA(辅蛋白酶)靶基因表达lexA靶基因表达但产物被分解rec