尘螨疫苗治疗对呼吸道天然免疫调节机制的研究

尘螨疫苗治疗对呼吸道天然免疫调节机制的研究目的:研究表明支气管哮喘削弱肺部天然免疫,增加感染和定植风险,尘螨疫苗特异性免疫治疗对哮喘有较好的疗效,而尘螨疫苗对肺部天然免疫的影响目前未见报道,因此本实验研究尘螨疫苗对哮喘宿主抗感染能力的影响,并探讨其可能的起效机制。方法:1.动物实验:①4-6周龄SPF级雌性Balb/c小鼠随机分为PBS对照组、哮喘组和尘螨疫苗治疗组。哮喘组和治疗组通过3次腹腔注射致敏和7次滴鼻激发建立哮喘模型,治疗组激发前进行皮下免疫治疗8次干预,对照组全程同步作PBS对照处理。末次激发24h后,测定小鼠气道反应性,肺泡灌洗液细胞分类计数,肺组织病理学检查,ELISA法测血清中抗原特异性IgE、IgG1和IgG2a水平。②4-6周龄SPF级雌性Balb/c小鼠随机分为PBS对照组、感染组、哮喘感染组和尘螨疫苗感染组。哮喘感染组和尘螨疫苗感染组通过3次腹腔注射致敏和7次滴鼻激发建立哮喘模型,尘螨疫苗感染组激发前进行皮下免疫治疗8次干预,感染组用PBS代替致敏、治疗和激发,感染组、哮喘感染组和尘螨疫苗感染组在末次激发后24h滴鼻感染绿脓杆菌,对照组全程同步作PBS对照处理。感染24h后测定小鼠肛温,肺泡灌洗液中细胞分类计数和细菌含量观察,肺组织病理学检查,肺匀浆涂板测定细菌负荷量。③4-6周龄SPF级雌性Balb/c小鼠随机分为PBS对照组、哮喘组和尘螨疫苗治疗组。哮喘组和治疗组通过3次腹腔注射致敏和7次滴鼻激发建立哮喘模型,治疗组激发前进行皮下免疫治疗8次干预,对照组全程同步作pbs对照处理。末次激发24h后elisa法测定小鼠肺泡灌洗液中抗菌肽cramp(cathelicidinrelatedantimicrobialpeptide)水平,免疫荧光法和实时荧光定量pcr法检测肺组织中cramp蛋白和基因表达,elisa法检测肺泡灌洗液中il-4、ifn-γ、il-10和tgf-β1浓度,免疫组织化学法检测cyp27b1表达。2.细胞实验:①空白培养基、25(oh)2vd3、tgf-β1+25(oh)2vd3、ifn-γ+25(oh)2vd3、il-10+25(oh)2vd3、tgf-β1、ifn-γ、il-10和1,25(oh)2vd3刺激人支气管上皮细胞后,实时荧光定量pcr法测人抗菌肽camp(cathelicidinantimicrobialpeptide)表达。②不同浓度tgf-β1刺激人支气管上皮细胞后,实时荧光定量pcr和免疫印迹法检测cyp27b1蛋白和基因表达。③itra预处理后,经25(oh)2vd3、tgf-β1+25(oh)2vd3和tgf-β1刺激人支气管上皮细胞,免疫印迹法和实时荧光定量pcr检测人抗菌肽camp蛋白和基因表达。④itra预处理后,经25(oh)2vd3、tgf-β1+25(oh)2vd3和tgf-β1刺激人支气管上皮细胞,再绿脓杆菌感染细胞,细胞匀浆涂板测定细胞内细菌含量。结果:1.动物实验:①尘螨疫苗治疗后小鼠penh值明显低于哮喘组(p<0.01),肺泡灌洗液中各炎性细胞均减少(均p<0.01),血清中特异性ige和igg1比哮喘组降低(均p<0.01),igg2a高于哮喘组(p<0.01),肺组织气道炎症减轻。②经尘螨疫苗治疗的小鼠肛温低于哮喘感染组(p<0.01),肺泡灌洗液中各炎性细胞均减少(均p<0.01),肺组织中和肺泡灌洗液中的细菌负荷均减少(均p<0.01),肺组织感染病变减轻。③尘螨疫苗治疗后小鼠肺泡灌洗液中cramp含量增加(p<0.01),肺组织中cramp的mrna(p<0.01)和蛋白(p<0.01)表达均升高,肺泡灌洗液中IFN-γ、TGF-β1和IL-10表达增高(均P<0.01),IL-4表达降低(P<0.01),肺组织中CYP27b1表达增加。2.细胞实验:①TGF-β1+25(OH)2VD3组、25(OH)2VD3组和1,25(OH)2VD3组细胞CAMPmRNA表达上调(均P<0.01),且TGF-β1+25(OH)2VD3组比25(OH)2VD3组更高(P<0.05)。②浓度为0.1ng/ml、1ng/ml和10ng/ml的TGF-β1增加人支气管上皮细胞CYP27b1蛋白和mRNA的表达(均P<0.01)。③ITRA降低TGF-β1+25(OH)2VD3对CAMP蛋白和mRNA的上调作用(均P<0.01)。④TGF-β1+25(OH)2VD3(P<0.01)和25(OH)2VD3(P<0.05)减少细胞内入侵的细菌数,并且TGF-β1+25(OH)2VD3组比25(OH)2VD3组(P<0.05)菌落数更少,而ITRA抑制了TGF-β1+25(OH)2VD3的作用(P<0.01)。结论:尘螨疫苗能有效减轻尘螨诱导的过敏性哮喘