尼古丁对血管功能和胰岛素敏感性的影响及机制研究

尼古丁对血管功能和胰岛素敏感性的影响及机制研究【目的】尼古丁是一个众所周知的经典化合物。它是烟草的主要成份之一。吸烟普遍被认为是动脉粥样硬化、高血压、糖尿病等多种心血管内分泌疾病的危险因素[1]。但这些不良作用是否是经由尼古丁产生的呢?现在看来,很多对尼古丁的研究结果由于研究方法、对象的不同仍存在矛盾、片面的地方,很多机制尚未阐明,因此不能单纯的断定吸烟的不良作用就是尼古丁产生的。相反,近期研究还发现了尼古丁的许多有益作用,比如抗炎、神经保护、改善肥胖大鼠的胰岛素抵抗等[2]。在本课题组前期建立的尼古丁长期治疗大鼠模型上,我们首次发现尼古丁治疗组大鼠的主动脉对硝普钠(一种一氧化氮供体药物)的内皮非依赖的舒张功能特异性的增强了。此外,该模型的胰岛素抵抗指数显著降低。这提示,尼古丁不仅可使血管中膜平滑肌一氧化氮信号通路增敏,还增强胰岛素敏感性。尼古丁主要经由尼古丁受体发挥作用。尼古丁受体属配体门控离子通道型受体,由5个亚基组成五聚体,亚基的种类有17种(α1-10,β1-4,γ/ε,δ),配体结合位点在α亚基上[3-6]。传统意义上,尼古丁受体分为肌肉型和神经型,前者介导神经肌肉接头传递,后者介导或调节神经系统的突触传递。最近研究显示,神经型尼古丁受体也可在许多非神经细胞中表达[5,6],而且,非神经细胞上尼古丁受体及其功能的发现,已经吸引不同领域科学家对这一经典受体产生新的研究兴趣。例如,免疫细胞上α7尼古丁受体的阐明,触发人们研究尼古丁受体激动剂对感染和炎症性疾病的治疗学意义。平滑肌细胞上,慢性尼古丁暴露可通过上调α7受体来增强胰岛素刺激的丝裂原信号通路。当前,在非神经组织(细胞)上考察尼古丁受体及其功能活性,将揭示尼古丁受体的新功能。而确定特定的尼古丁功能受体,对于发挥尼古丁有益的治疗作用意义重大。综上所述,本课题拟深入研究尼古丁长期治疗对血管功能和胰岛素敏感性的影响和机制,这不仅有利于明确尼古丁对心血管和内分泌系统的作用,揭示尼古丁受体的新功能和血管舒张新通路,也对寻找治疗血管疾病和胰岛素抵抗的新靶点具有重要意义。【方法】第一部分:尼古丁对血管功能的影响及机制研究。该部分研究首先在本课题组前期建立的大鼠尼古丁长期治疗模型上考察主动脉外膜、内膜抗收缩功能;内膜依赖的血管舒张功能;中膜收缩和内膜非依赖的舒张功能。接着,进一步考察尼古丁增强中膜一氧化氮舒张反应机制。一方面在大、小鼠尼古丁治疗模型上考察尼古丁对中膜舒张反应影响的时间过程以明确该作用是急性作用还是慢性作用,另外还观察了尼古丁治疗后对胰岛素引起的中膜舒张反应的影响以初步判断尼古丁致舒张反应增强作用是否具有普遍意义。然后在离体血管实验中运用抑制剂和拟似物,检测关键蛋白表达和活性的方法明确该作用是否经由一氧化氮信号通路的3’,5’-环鸟苷一磷酸(cGMP)依赖的信号通路。随后,通过制备基因芯片分析预测和经典通路上逐步排查的方法,寻找尼古丁改变的一氧化氮通路下游可能的靶点,如环氧合酶-2、内质网钙泵、AMPK、Rho等,再通过Western-blot,以及血管功能实验等方法进行验证,最终确认靶点。另一方面制备尼古丁受体阻断剂和尼古丁同时治疗的动物模型并使用α7尼古丁受体敲除小鼠进行尼古丁长期治疗,再进行血管功能实验从而寻找介导该作用的尼古丁受体。最后运用清醒测压技术,检测尼古丁模型组与生理盐水组血压等指标的差别。第二部分:尼古丁对胰岛素敏感性的影响及机制研究。首先在尼古丁长期治疗的正常大鼠模型上通过血清学胰岛素抵抗指数、整体胰岛素耐量实验和糖耐量实验等多个指标验证尼古丁对胰岛素增敏的作用。接着针对机制研究,一方面在整体水平进行尼古丁给药模型的各部位脂肪称重,另一方面,在第一部分制备的尼古丁给药组和生理盐水组的主动脉基因芯片上寻找胰岛素敏感性相关基因的改变。同时,检测尼古丁治疗大鼠模型的四种胰岛素敏感组织(骨骼肌、肝脏、内脏脂肪和皮下脂肪)的关键蛋白(PPAR-γ、COX-2、AMPK)表达水平,从而寻找尼古丁影响的靶蛋白。另一方面,制备外周尼古丁受体阻断剂和尼古丁同时治疗的动物模型,以确认尼古丁致胰岛素增敏的中枢或外周受体机制。【结果】第一部分:尼古丁对血管功能的影响及机制研究1.尼古丁长期治疗不影响主动脉外膜和内膜的抗收缩功能;不影响内膜依赖的舒张功能;不影响中膜平滑肌对新福林的收缩作用,而特异性的增强硝普钠(一氧化氮供体)引起的内皮非依赖性的中膜舒张反应。2.尼古丁治疗后Sprague-Dawley(SD)大鼠和C57BL/6J小鼠中膜收缩反应不改变,但硝普钠引起的内皮非依赖性的中膜舒张反应都显著增强。大鼠治疗3周出现该现象,6周稳定出现该现象。小鼠治疗4周出现该现象,6周稳定出现该现象。尼古丁治疗后SD大鼠中膜对胰岛素引起的舒张反应也显示增强。这说明该增强作用是长期慢性的作用结果而非急性作用。3.硝普钠引起的生理盐水和尼古丁组的舒张反应可被可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ完全阻断,可被cGMP模拟物模拟,可被cGMP依赖的蛋白激酶(PKG)抑制剂阻断,而PKG蛋白表达在两组间不改变,蛋白活性没有明显差异。这提示该舒张增敏机制是经由PKG信号通路,且发生在PKG的下游靶位。4.主动脉芯片结果显示与一氧化氮通路舒张相关基因中尼古丁治疗组内质网钙泵基因sarco(endo)plasmicreticulumcalcium-ATPase3(SERCA3)较生理盐水组上调1.56倍,热休克蛋白27(Hsp27)较生理盐水组下调0.51倍。另外与一氧化氮通路尚无报道关联的COX-2基因表达显著下调0.09倍,我们也将它作为可能影响舒张通路的备选基因。5.根据芯片结果进行验证:COX-2蛋白表达在尼古丁组主动脉平滑肌显著下调,而COX-2非选择性抑制剂Indomethacin和选择性抑制剂Meloxicam都不能取消尼古丁组和生理盐水组间血管舒张反应的差别;内质网钙泵抑制剂Thapsigargin不能取消尼古丁组和生理盐水组间血管舒张反应的差别;尼古丁组主动脉与收缩相关蛋白Hsp27表达不变。这些结果排除了SERCA3、Hsp27和COX-2参与舒张增敏的机制。6.进一步使用Rho激酶抑制剂Y-27632不能取消尼古丁组和生理盐水组间血管舒张反应的差别,这排除了尼古丁经由抑制Rho通路从而使钙收缩脱敏以增强舒张的可能。7.运用AMPK抑制剂CompondC不能取消尼古丁组和生理盐水组间血管舒张反应的差别,又排除了最新提出的AMPKα1舒张通路的参与。8.使用非选择性阻断剂20mM的Tetraethylammonium(TEA)阻断钙激活钾通道和电压依赖性钾通道可完全取消尼古丁组和生理盐水组的舒张反应差别,而选择性阻断ATP敏感钾通道(KATP)和内向整流钾通道(Kir)都不能取消两组间血管舒张反应的差别。进一步选择性阻断大电导钙激活钾通道(BKCa)以及阻断4-AP敏感的电压依赖性钾通道却都不能取消尼古丁组和生理盐水组的舒张反应差别。而等渗高钾液(80mM)可取消硝普钠引起的尼古丁组和生理盐水组的舒张反应差别。这说明尼古丁致硝普钠舒张增敏的机制是经由TEA敏感的钾通道,而不是的BKCa、KATP、Kir和4-AP敏感的电压依赖性钾通道。9.外周神经型尼古丁受体阻断剂Hexamethonium和尼古丁同时治疗可以取消尼古丁组和生理盐水组间硝普钠引起的血管舒张反应差别。而尼古丁治疗的α7尼古丁受体敲除小鼠,硝普钠引起的血管舒张反应增强现象仍然存在,说明尼古丁使舒张增敏的机制是经由外周非α7尼古丁受体产生。10.尼古丁长期给药后不影响基础状态的收缩压、舒张压和平均动脉压但延长心动间期;不影响硝普钠(3μg/kg,10μg/kg,30μg/kg,100μg/kg)急性给药引起的血压下降。第二部分:尼古丁对胰岛素敏感性的影响及机制研究1.尼古丁长期治疗后不影响血清血糖水平,但显著减少胰岛素和甘油三酯水平,显著减少HOMA法的胰岛素抵抗指数,说明基础状态下的胰岛素增敏。2.尼古丁治疗3周和6周后胰岛素耐量实验和葡萄糖耐量实验都显示尼古丁组血糖降低的速度和幅度较生理盐水组和生理盐水限食组都更为显著,说明刺激状态下的胰岛素增敏。3.尼古丁长期治疗后皮下脂肪和内脏脂肪都明显减少,且内脏脂肪减少更为显著。4.主动脉基因芯片显示尼古丁给药后脂代谢相关基因如脂酶、肾上腺素受体β3显著上调;能量消耗相关基因解耦联蛋白1显著上调;胰岛素敏感性相关基因过氧化物酶增殖体受体(PPARγ)显著上调。5.尼古丁治疗不影响PPARγ蛋白在骨骼肌、肝脏、内脏脂肪和皮下脂肪的表达。尼古丁治疗显著减少骨骼肌COX-2表达,而不改变肝脏、内脏脂肪和皮下脂肪的表达。尼古丁治疗显著增加内脏脂肪和下丘脑AMPK表达,而不改变骨骼肌、肝脏和皮下脂肪的表达。6.外周尼古丁受体阻断剂合并尼古丁治疗并不阻断尼古丁增强胰岛素敏感性的作用,但阻断尼古丁减少血清甘油三酯,说明尼古丁致胰岛素增敏主要经由中枢机制。【结论】本课题主要发现并探讨了尼古丁两个全新的作用和机制:一、尼古丁长期治疗可特异性增强主动脉中膜对一氧化氮的舒张反应。该增敏作用是尼古丁经由非α7的外周神经型尼古丁受体影响了PKG下游途径产生。SERCA3、Hsp27和COX-2不参与该下游增敏途径;Rho和AMPK也不参与该下游增敏途径。该增敏途径是通过增强PKG下游的TEA敏感钾通道开放,引起细胞