发酵工艺原理课件

生物工程概述基因工程基因工程是通過DNA重組技術,對生物材料進行改良,構建出新型的微生物菌株、培育出新的動植物品種,使其具有優良的符合人們意願的性狀，或獲得所需要的產物。

稀少珍貴的蛋白質藥物1982年，美國食品與藥物管理局批准了首例基因工程產品—人胰島素投放市場——它標誌了基因工程產品正式進入到商業化階段。人生長激素、表皮生長因數、腫瘤壞死因數、a-干擾素、纖維素酶、抗血友病因數、紅細胞生成素、尿激酶原、白細胞介素-2、集落刺激因數、乙肝疫苗等等

畜牧業中的應用動物疫苗、生長激素等例：動物乳腺反應器

種植業中的應用用攜帶外源基因的農桿菌Ti質粒轉化植物原生質體，使外源DNA與植物染色體DNA整合，通過原生質體的培養分化成愈傷組織，最後發育成具有新性狀的完整植株—轉基因植物

種植業中的應用抗化學除草劑基因轉基因番茄蛋白質工程：通過對蛋白質分子結構的合理設計，利用基因工程的手段生產出具有更高生物活性或獨特性質的蛋白質。蛋白質工程的主要步驟通常包括：（1）從生物體中分離純化目的蛋白；（2）測定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射線晶體衍射等手段，盡可能地瞭解蛋白質的二維重組和三維晶體結構;（4）設計各種處理條件，瞭解蛋白質的結構變化，包括折疊與去折疊等對其活性與功能的影響；（5）設計編碼該蛋白的基因改造方案，如點突變；（6）分離、純化新蛋白，功能檢測後投入實際使用。高等植物細胞培養高等植物細胞具有全能性。從高等植物的幼胚、根、莖、葉、花和果實等不同器官的組織中分離的單個細胞，經過特殊培養形成愈傷組織，並可進一步誘導生成完整的植株。高等植物細胞培養動物細胞培養細胞重構技術細胞重組是把不同種類的細胞的部件重新組合裝配。細胞融合是將不同種類的兩種細胞經過特殊處理後放在一起，在某些促融因數作用下發生融合，形成雜種細胞。原生質體融合現代發酵工程主要指利用利用微生物、動植物細胞和基因工程菌在在人工生物反應器（發酵罐）中培養而獲得產物的工業過程。現代發酵工程是生物代謝、微生物生長動力學、大型發酵罐或生物反應器研製、化工原理等密切結合和應用的結果。

發酵工程離子交換的應用蒸發和結晶技術的應用過濾膜技術色層分離技術應用生物技術的基本內容（幾大領域）：基因工程：用“剪刀+糨糊”創造新物種的工程。細胞工程：微觀水準的嫁接技術酶工程：讓工廠高效、安靜、美麗如畫的工程。發酵工程：把微生物或細胞造就成無數微型工廠，將神話變為現實的橋樑。蛋白質工程：巧奪天工的技術。第二節發酵工程概述一.什麼叫發酵二．發酵工程的發展史三.發酵工業的特點四.發酵工業的範圍

一、發酵的定義（fermentation)1、傳統發酵2、生化和生理學意義的發酵3、工業上的發酵1、傳統發酵

fervere”

發泡最初發酵是用來描述酵母菌作用於果汁或麥芽汁產生氣泡的現象，或者是指酒的生產過程。2、生化和生理學意義的發酵指微生物在無氧條件下，分解各種有機物質產生能量的一種方式，或者更嚴格地說，發酵是以有機物作為電子受體的氧化還原產能反應。如葡萄糖在無氧條件下被微生物利用產生酒精並放出CO2。3、工業上的發酵

利用微生物、植物、動物，在合適的條件下，經特定的代謝途徑轉變成所需產物的過程。包括：1.厭氧培養的生產過程，如酒精，乳酸等。2.通氣（有氧）培養的生產過程，如抗生素、氨基酸、酶製劑等。發酵的分類

1.

按獲取能量的方式分——好氧發酵，厭氧發酵2.

按產物類型分——初級代謝物發酵，次級代謝物發酵；食品發酵，有機酸發酵，氨基酸發酵，維生素發酵，抗生素發酵……3.

按操作類型分——自然發酵，純種發酵，混種發酵；分批發酵，半連續發酵，連續發酵；固態發酵，液態發酵4.按發酵生物類型分——細菌發酵，真菌發酵，基因工程菌發酵，動植物細胞發酵

SOLID-STATEFERMENTATIONPRODUCTION二．發酵工程的發展史

1．發酵現象的發現與利用2.小生命體的發現3.發酵本質的闡明4.純粹培養技術的開發5.發酵中酶催化反應的發現6.大規模液體沉沒發酵技術的開發7.現代生物技術的應用

三、發酵工業的特點優點1.產物結構複雜性和特異性：手性或光學活性2.過程安全性：水相、常溫、常壓、中性、不燃不爆3.主要原料可再生性：陽光和土地4.原料可替換性5.反應自控性6.設備通用性7.副產物可綜合利用性8.生產能力可提高性：突變與基因擴贈9.產物類型可塑性：突變與轉基因缺點1.副產物多，分離精製困難2.反應速度慢3.原料轉化率低4.反應濃度低5.生產穩定性差6.設備龐大，輔助設備多，投資大7.廢水、廢渣排放量大，處理費用高8.生產過程容易受到其他微生物的污染9.通氣、攪拌、冷卻等能耗大四、發酵工業的範圍1．發酵食品工業(FermentedFoods)

：醬油，食醋，豆瓣醬，酸菜，活性酵母，活性乳酸菌，麵包，優酪乳，乳酪，醬豆腐，納豆、白酒，黃酒，米酒，葡萄酒，啤酒，果酒。2．有機酸發酵工業OrganicAcids

：醋酸，乳酸，檸檬酸，葡萄糖酸，蘋果酸，衣康酸，琥珀酸，丙酮酸，反丁烯二酸等。3．氨基酸發酵工業AminoAcids

：谷氨酸，賴氨酸，色氨酸，蘇氨酸，精氨酸，酪氨酸，異亮氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸等。

四、發酵工業的範圍4．低聚糖與多糖發酵工業oligosaccharidesandpolysaccharides：低聚果糖，香菇多糖，雲芝多糖，葡聚糖，黃原膠等。5．核苷酸發酵工業Nucleotides

：肌苷酸（IMP），鳥苷酸（GMP），黃苷酸（XMP）。6．藥物發酵工業Pharmaceutical：抗生素:青黴素，頭孢菌素，鏈黴素，紅黴素，四環素，制黴菌素，絲裂黴素等。基因工程制藥工業：促紅細胞生成素（EPO），集落刺激因數（CSF），表皮生長因數（EGF），人生長激素，干擾素，白介素，各種疫苗，單克隆抗體等。藥理活性物質發酵工業：免疫抑制劑，免疫啟動劑，糖苷酶抑制劑，脂酶抑制劑，類固醇激素等四、發酵工業的範圍四、發酵工業的範圍7．維生素發酵工業vitamin：維生素C，維生素B2，維生素B12等。8．酶製劑發酵工業Enzymes

：澱粉酶、蛋白酶、脂酶、青黴素醯化酶、葡萄糖氧化酶、海因酶等。9.發酵飼料工業Feedstuff

：幹酵母、單細胞蛋白、酵素菌、益生菌、青貯飼料、抗生素和維生素飼料添加劑等。10生物肥料與農藥工業：

biofertilizerandbiologicalpesticide細菌肥料、赤黴素、除草菌素、蘇雲金桿菌、白僵菌、綠僵菌、殺稻瘟菌素、有效黴素、春日黴素等。11.溶劑發酵工業：Solvent酒精、甘油、乙醇、丙酮、丁醇溶劑等。12..水的生物處理工業及環保：EnvironmentalApplication(WasteTreatment)活性污泥、沼氣發酵、有毒物質降解等。

四、發酵工業的範圍WTO帶來的機遇和挑戰發酵工業的產業特點：1、技術中等複雜而又相對成熟（不屬於高端技術）2、勞動中等密集、資源消耗較大，污染大。

所以從國際產業分工格局的趨勢看，理應由發達國家轉移到優秀的發展中國家來。而中國是發展最快的發展中國家，有很好的產業基礎和人力資源，進入WTO之後，中國可以更直接地參與國際產業分工，所以應當成為世界發酵第一大國和第一強國。

WTO帶來的機遇和挑戰發酵產業在我省區域經濟中是最具特色的，石家莊是全國發酵工業的中心，是醫藥原料抗生素、維生素的生產基地。“藥都”的提出意味著石家莊市可能成為中國發酵產業的第一大市和第一強市。天時和地利都已齊備。菌種篩選搖瓶試驗發酵罐中試由實驗室研究到產業化的過程發酵生產發酵工程的基本技術過程Theessentialcomponentsofafermentor發酵的主體設備發酵工程生產產品的流程圖《發酵工程工藝原理》課程的內容緒論培養基生產菌種的選育滅菌與無菌空氣的製備生產菌種的製備發酵動力學發酵工藝過程控制染菌的防治主要參考書：

《發酵工藝原理》中國醫藥科技出版社《新編生物工藝學》華東化工大學出版社《生物化學工程》上海科學技術出版社《微生物工程工藝原理》華南理工大學出版社《現代生物技術概論》北京師範大學出版社《微生物工程》科學出版社

《發酵工業概論》中國輕工業出版社

主要專業期刊微生物學報微生物學通報食品與發酵工業工業微生物生物工程學報生物工程進展食品與生物技術生物技術通報醫藥生物技術

專業站點生物引擎：美國化學網資料庫群：

/databases美國國立醫學圖書館Pubmed資料庫/PubMed中國生物工程網：生物橋：生物論壇：中國發明專利技術資訊網：

歐洲專利條約組織：

中國數字圖書館：5/一、發酵過程檢測控制的主要的參數

1、物理參數檢測參數檢測方法

單位

影響溫度鉑電阻

熱敏電阻

℃

μqPc*罐壓(0.20.5×105Pa)隔膜感測器壓敏電阻Pa保持正壓，防止染菌O2及CO2

的溶解度攪拌轉數頻率計數器

r/minKla發酵液的均勻性

攪拌功率(2-4KW/m3)功率計KwKla空氣流量浮子流量計

孔板差壓計

m3

h-1vvmKla粘度旋轉粘度計

Pa

sKla濁度濁度計%反映單細胞的生長

料液的流量蠕動泵

荷重感測器量筒L

h-1

S發酵過程檢測控制的主要的參數

2、化學參數檢測參數檢測方法

單位

影響及作用PH複合玻璃電極

菌體和產物合成速度酶促反應的方向基質濃度產物濃度HPLC離子選擇電極生物感測器取樣g

L-1

μqP發酵週期的長短氧化還原電位氧化還原電位電極mV生長和生化活性溶氧濃度覆膜氧電極

%qo2氣相O2含量

順磁氧分析儀

Pa反映OUR和Kla氣相CO2含量

紅外氣體分析儀

%反映OUR和Kla發酵過程檢測控制的主要的參數

3、生物參數檢測參數檢測方法

單位

影響菌絲形態攝像顯微鏡取樣鏡檢

反映菌體發育階段和正常與否菌體濃度取樣：幹重、濁度、活菌計數、離心沉降g

L-1

影響菌體的生化反應KlaμqPqSqo2(OUR)CER(Co2釋放速率)RQ(呼吸商:CER/OUR)YxsYps

Kla等

發酵過程檢測控制的主要的參數

4、間接狀態參數二、控制方式

一般檢控系統包括3個部分。

1．測定元件：如溫度計、壓力錶、電流計、pH計直接測定發酵過程的各種參數，並輸出相應信號。

2．控制部分：其功能主要是將測定元件測出的各種參數信號與預先確定值進行比較，並且輸出信號指令執行元件進行調整控制。3．執行元件：它接受控制部分的指令開啟、或關閉有關閥門、泵、開關等調節控制機構，使有關參數達到預定位置。手動控制和自動控制發酵控制FermentationControl

SampleAnalysispHDOSugarAmmoniaPhosphateSulphateProductsPrecursorsContaminationPressureprobeLevelprobepHprobeTemp.probeDOprobeAntifoamAcid/BaseCoolingAir/agitationSugar/OilfeedPenicillinFermentationProfile變化曲線第一節溫度的影響及控制一、溫度對發酵的影響：影響各種酶促反應的速度酶活溫度發酵溫度升高，生長代謝加快，生產期提前。發酵溫度太高，菌體容易衰老，發酵週期縮短。改變發酵液的物理性質：溫度影響基質和氧的吸收速度影響飽和溶氧濃度改變菌體代謝產物的合成方向例：溫度小於30℃，合成金黴素的能力強溫度等於35℃，只合成四環素二、影響發酵溫度變化的因素：

發酵熱（KJ/m3h）發酵熱=生物熱+攪拌熱-蒸發熱-顯熱-輻射熱生物熱：產生菌在生長繁殖過程中，釋放的大量熱量。影響生物熱的因素：與菌種遺傳特性有關與菌齡有關：對數生長期生物熱最大。與營養基質有關與產量有關攪拌熱：由於攪拌器的轉動引起液體的摩擦產生的熱量。蒸發熱：發酵液蒸發水分帶走的熱量。攪拌熱=P3600/V顯熱：發酵排氣散發帶走的熱量。輻射熱：由於罐內外的溫差，輻射帶走的熱量。三、最適發酵溫度的選擇選擇既適合菌體生長又適合代謝產物合成的溫度可實行變溫控制：在生長階段選擇適合菌體生長的溫度，在產物合成階段，選擇適合代謝產物合成的溫度。確定最適發酵溫度還應參考其他發酵條件：在較差通氣條件下，降低發酵溫度對發酵有利培養基成分較易被利用或較稀薄時，降低發酵溫度有利四、發酵溫度的控制在發酵罐上安裝夾套和蛇罐，通過迴圈冷卻水控制。冷卻介質：深井水或冷凍水控制方式：手動控制或自動控制溫度計溫度控制器調節閥第二節pH的影響及控制一、pH對發酵的影響：影響菌體生長代謝的酶活性影響代謝產物的合成方向影響菌體原生質膜電荷的改變，引起膜對離子的滲透作用，影響了營養物的吸收和代謝產物的分泌。pHGrowth2-3pHunitspH的變化決定於所用的生產菌：培養基中營養物質的代謝引起pH的變化：培養基pH在發酵過程中能被菌體代謝所改變。若陰離子氮源被利用後產生NH3

，則pH上升；有機酸的積累，使pH下降。一般來說，高碳源培養基傾向於向酸性pH轉移，高氮源培養基傾向於向鹼性pH轉移，這都跟碳氮比直接有關。生理酸性物質和生理鹼性物質的消耗二、影響發酵pH變化的因素：根據不同菌種的生理特性，確定不同的最適pH同一菌種根據不同階段，生長期採用最適生長的pH，在產物採用最適產物合成的pH。三、最適pH的選擇四、pH的控制採用合適的培養基配比C：N合適生理酸性物質和生理鹼性物質比例合適添加緩衝物質：碳酸鈣和磷酸鹽在發酵過程中直接補加酸或堿過去流加硫酸或氫氧化鈉，現採用補加氨水、尿素、硫酸銨在發酵過程中調節補糖速度控制pH幾種具體情況的調節方法當pH低，氨基氮含量低時當pH高，氨基氮含量低時當pH高，氨基氮含量高時當pH由於多加了削沫劑而下降時pH的控制系統pH電極設定控制器調節閥6.5pHUncontrolledControlled經消毒的pH電極裝入發酵罐內定時直接測定培養基的pH，同時還可以與控制儀錶連結，通過回路系統控制閥門或泵進行pH調節。菌體濃度的增加速度（生長速度）與微生物的種類和自身的遺傳特性有關第三節菌體生長速度和菌體濃度的影響及控制影響菌體濃度的因素菌體濃度的增加速度（生長速度）與營養基質的種類和濃度有關（μ正比於S）當存在基質抑制作用時或造成高滲透壓時，高濃度營養基質引起生長速率下降。菌體濃度的增加速度（生長速度）受環境條件的影響最適菌體濃度的確定優化控制的目標：在最短的時間內產生最大量的產物。(dP/dtMAX)dP/dt

=qPXqP=f〔X，μ，qO2

qSCL〕以青黴素發酵為例qP/qPmμ

/μm1.0-1.0青黴素發酵的qP與μ的關係μCμ＞μCqP可維持在qPmaxμ＜μCqP隨μ減小而減小要保證生產菌獲得最大的比生產速率，就必須維持較大的比生長速率。但是，過高的比生長速率造成過高的菌體濃度，造成不利影響：過高的比生長速率和過高的菌體濃度造成的不利影響：1、μ過高，S消耗過快，有限的營養基質只能用於生長，而不足於產物合成。2、有毒中間產物的快速積累，會改變菌體的代謝途徑，抑制產物合成。3、X過高，增加OUR，且發酵液粘度增大，減小OTR。CL減小，抑制菌體生長和產物合成。最適X？最適μ為等於或稍大於μC青黴素發酵的qP、OUR、OTR與X的關係1.0-X

/Xm1.0OURqP/qPmOTRdp/dtXCOUR=OTR時的菌體濃度為最適菌體濃度，

在發酵過程中，控制目標為保持穩定的臨界菌體濃度和臨界比生長速率，以維持呼吸臨界溶氧濃度為前提的耗氧速率與供氧速率的平衡，從而使產物合成速率和比速率達到最大值。

生長速度和菌體濃度的控制方法確定基礎培養基的適當配比，防止培養基過於豐富或過於稀薄。通過調節中間補料的速度和量來控制。第四節營養基質的影響及控制

一、碳源種類：葡萄糖優點：吸收快，利用快，能迅速參加代謝合成菌體和產生能量缺點：有些品種產生分解產物阻遏效應。一）、碳源種類的影響及控制迅速利用的碳源緩慢利用的碳源種類：澱粉、乳糖、蔗糖、麥芽糖、玉米油優點：不易產生分解產物阻遏效應。有利於延長次級代謝產物的分泌期缺點：溶解度低，發酵液粘度大。

發酵工業中常採用含迅速利用的碳源和緩慢利用的碳源的混合碳源。迅速利用的碳源滿足菌體生長的消耗，緩慢利用的碳源，滿足產物合成，可延長合成期，提高產量，並可解除葡萄糖效應。碳源種類的控制二）、碳源濃度的影響S過小μ＜μCqP隨μ減小而減小S過大μ＞＞μCX＞＞XCOUR增大CL＜CLCqP減小粘度增大Kla減小產生分解產物阻遏作用的碳源濃度過大，會抑制產物合成。三）、碳源濃度的控制在發酵過程中，補加糖類控制碳源濃度補料的類型：1、流加2、少量多次的加入3、多量少次的加入殘糖量pH值QcX粘度溶氧尾氣中O2和CO2的含量發酵液的總體積補糖的依據：根據經驗，以最高產量的罐批的加糖率為指標，並依據菌體濃度、一定時間內的糖比消耗速率和殘糖等加以修正。例：青黴素發酵開始補糖在殘糖降至1.5%,pH開始回升時補糖。補糖量以最高罐批經驗量為參考。每小時前期0—40h中期40—90h後期90以後加糖量0.08%-0.15%0.15%-0.18%0.15%-0.18%補糖量的控制：

經驗法：補糖量的控制：

動力學方法依據μ、qP、qC等動力學參數

之間的關係，計算加糖量以次級代謝產物為例：μ、qP、qC之間的關係：X

μqpqCS控制原則：以維持臨界生長限制基質濃度、臨界菌體濃度和臨界比生長速率為指標的基質流加速率與消耗速率的平衡。具體方法：1、求X0測定XOTROURXXCOUROTRX02、求μ、qp在發酵過程中，測定每小時菌體幹重X和產物P計算每小時μ、qpμ=△X/△tXqp=△P/△tX3、確定適宜的μ—μ0qPμμC確定μ0等於或稍大於μC可使qP達到qPmax4、確定適宜的qC

qC0=m+μ0/Yxs+qPmax/Yps5、根據物料平衡計算加糖速率每小時加糖量=qC0X0v–發酵液的殘糖量補料液的含糖量qC=m+μ/Yxs+qP/Yps補糖的控制把計算的加糖量，輸入電腦，由電腦控制加料裝置精確控制加入的糖量。二、氮源的影響和控制

一）氮源的種類影響種類：氨水、銨鹽和玉米漿優點：易被菌體利用，明顯促進菌體生長缺點：對於有些品種高濃度的銨離子抑制產物合成迅速利用的氮源緩慢利用的氮源種類：黃豆餅粉、花生餅粉、和棉子餅粉優點：利用緩慢，有利於延長次級代謝產物的分泌期。防止早衰。缺點：溶解度低，發酵液粘度大。

發酵工業中常採用含迅速利用的氮源和緩慢利用的氮源的混合氮源。迅速利用的氮源促進菌體生長繁殖，緩慢利用的碳源，滿足產物合成，可延長合成期，延緩自溶期。二）氮源種類的控制三）氮源濃度的影響控制補氮的依據：殘氮量、pH值、菌體量氮源濃度對菌體生長和產物合成的量與方向都有影響。氮源濃度的控制：控制基礎培養基中的配比。通過補加氮源。補氮量的控制：經驗法：依據使pH升高0.1而通入氨水的量來計算。依據殘氮量和工藝控制殘氮量來計算。例：土黴素發酵50m3發酵罐使pH升高0.1通氨量為10升。使氨基氮上升0.004%-0.005%。動力學方法；通過qN、μ、qP，計算每小時的補氮量。磷酸鹽能明顯促進產生菌的生長。（0.32-300mM）對於次級代謝產物，高濃度的磷酸鹽能抑制產物合成。（10mM以下）三、磷酸鹽的影響和控制

一）磷酸鹽源的影響二）磷酸鹽濃度的控制一般在基礎培養基中採用適宜濃度。對於初級代謝產物，磷酸鹽濃度採用足量。對於次級代謝產物，磷酸鹽濃度採用生長亞適量。一般磷酸鹽採用單消，防止發生沉澱反應使溶磷量達不到最適量。要控制有機氮源中的磷含量，以防溶磷量超過最適量。當菌體生長緩慢時，可適當補加適量的磷，促進菌體生長。一、泡沫對發酵的影響泡沫的持久存在影響著微生物對氧的吸收，妨礙二氧化碳的排除，因而破壞其生理代謝的正常進行，不利於發酵；使發酵液的裝料係數減少。由於泡沫大量生成，致使培養液的容量一般只能等於種子罐容量的一半左右，大大影響了設備的利用率。大量的泡沫易造成逃液。增加污染雜菌的機會。造成巨大損失。第五節泡沫的影響及其控制二、泡沫的控制方法減少培養基中易起泡的成分減少培養基中粘度大的成分適當減少通氣量及攪拌轉速採用機械消泡（罐內裝置和罐外裝置）採用削沫劑消泡工業上常用的消泡劑天然油脂類

玉米油、豆油、棉籽油、魚油等高碳醇類

十八醇、乙二醇聚合物聚醚類

聚氧丙烯甘油、聚氧乙烯丙烯甘油矽酮類

聚二甲基矽氧烷泡沫的檢測和控制最簡單的檢測是定時在發酵罐視孔上觀察泡沫產生情況，發現泡沫持續上升時，開啟消泡劑貯罐的閥門，流加少量消泡劑，使泡沫消失即可。也可在罐內頂部裝液位儀與控制儀錶連結，用以控制消泡貯率閥門的開啟。當泡沫上升接觸探頭頂端時產生的信號，通過控制裝置，指令打開泵開關或閥門，自動加入消泡劑，泡沫消失，信號也隨之消失，閥門關閉。消泡劑使用的注意事項：不能用量過大細密地擴散到泡沫效果好加入土溫-80具有增效作用多種消泡劑並用

溶氧(DO)是需氧微生物生長所必需。在發酵過程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成為控制因素。

在28℃氧在發酵液中的100％的空氣飽和濃度只有0.25mmol.L-1左右，比糖的溶解度小7000倍。在對數生長期即使發酵液中的溶氧能達到100％空氣飽和度，若此時中止供氧，發酵液中溶氧可在幾分鐘之內便耗竭，使溶氧成為限制因素。第六節氧的供需及對發酵的影響第一節微生物對氧的需求一、描述微生物需氧的物理量比耗氧速度或呼吸強度（QO2）：單位時間內單位體積重量的細胞所消耗的氧氣，mmolO2·g菌-1·h-1

攝氧率(r)：單位時間內單位體積的發酵液所需要的氧量。mmolO2·L-1·h-1

。r=QO2.X二、溶解氧濃度對菌體生長和產物形成的影響CCrQO2CLCCr:

臨界溶氧濃度,指不影響呼吸所允許的最低溶氧濃度。一般對於微生物：CCr:

＝1～15%飽和濃度例：酵母4.6*10-3mmol.L-1,1.8%

產黃青黴2.2*10-2mmol.L-1,8.8%定義：氧飽和度＝發酵液中氧的濃度/臨界溶氧溶度所以對於微生物生長，只要控制發酵過程中氧飽和度>1.問題：一般微生物的臨界溶氧濃度很小，是不是發酵過程中氧很容易滿足。例：以微生物的攝氧率0.052mmolO2·L-1·S-1

計，

0.25/0.052=4.8秒注意：由於產物的形成和菌體最適的生長條件，常常不一樣：

頭孢菌素捲鬚黴素生長5%(相對於飽和濃度）13%產物>13%>8%三、影響需氧的因素r=QO2.X

菌體濃度QO2

遺傳因素

菌齡

營養的成分與濃度

有害物質的積累

培養條件第二節反應器中氧的傳遞一、發酵液中氧的傳遞方程CCiPPi氣膜液膜N：傳氧速率kmol/m2.hkg:氣膜傳質係數kmol/m2.h.atmKl:液膜傳質係數m/hC*＝P/H,與氣相中氧分壓相平衡的液體中氧的濃度Kl:以氧濃度為推動力的總傳遞係數(m/h)再令：單位體積的液體中所具有的氧的傳遞面積為a(m2/m3)Nv：體積傳氧速率kmol/m3.hKla:以(C*-C)為推動力的體積溶氧係數h-1二、發酵液中氧的平衡發酵液中供氧和需氧始終處於一個動態的平衡中傳遞：消耗：r=QO2.X氧的平衡最終反映在發酵液中氧的濃度上面三、供氧的調節C有一定的工藝要求，所以可以通過Kla和C*來調節其中C*＝P/HNvHPKla第六章氧的供需及對發酵的影響調節Kla是最常用的方法，kla反映了設備的供氧能力，一般來講大罐比小罐要好。

45升1噸10噸攪拌速度250rpm120120供氧速率7.610.720.1第三節影響Kla的因素

Kla反映了設備的供氧能力，發酵常用的設備為搖瓶與發酵罐。一、影響搖瓶kla的因素為裝液量和搖瓶機的種類搖瓶機往復，頻率80-120分/次，振幅8cm旋轉，偏心距25、12,轉述250rpm裝液量，一般取1/10左右：

250ml15-25ml500ml30ml750ml80ml例：

500ml搖瓶中生產蛋白酶，考察裝液量對酶活的影響裝液量30ml60ml90ml120ml

酶活力71373425392二、影響發酵罐中Kla的因素已知在通風發酵罐中，全擋板條件下：Kla=K[(P/V)α(vs)β(ηapp)-w]P/V—

單位體積發酵液實際消耗的功率（指通氣條件下）。（KW/m3

）Vs—

空氣的直線速度（m/h），截面積一定，反映的空氣的體積流量（m3/h)（vvmm3/m3min)ηapp—發酵液的粘度（kgs/m2)α、β、w—指數，與攪拌器和空氣分佈器的形式有關K—經驗常數1、理論上分析KLand通氣量提高攪拌，調節kla的效果顯著例某一產品的發酵

dnp0/vc產量

4501801.6220%49784502802.1240%55645501802.6160%8455例黑麯黴生產糖化酶

n230230270

通氣比1:0.81:1.21:0.8

產量181224162846提高d、n顯著提高C,提高了產量提高N,比提高Q有效2、實際上：對於轉速的調節有時是有限度的通風的增加也是有限的蒸發量大中間揮發性代謝產物帶走例：紅麯黴生產色素用於食品工業，靜止培養改為通氣培養，比色法測定產量：通氣靜止1.42.03.16.819.5OD0.280.78.315.614.36.2提高下降所以這些因素的存在，發酵設備的供養是有限的3、小型發酵罐和大型發酵罐調節kla的特點

小型發酵罐，轉速可調

大型發酵罐，轉速往往不可調

大型反應器的合理設計

對現有設備一定要注意工藝配套4、影響Kla的其他因素空氣分佈器液體的粘度傳質介質溶氧濃度的變化及其控制一、典型的分批發酵中氧濃度的變化規律（一定Kla下）：rXQCL一般有一個低谷，在對數生長的末期二、發酵過程中溶氧的控制1、溶氧控制的策略微生物反應:

XS→P+Xπ=a+bμ菌體生長期：酶系統Ⅰ酶系統Ⅱ關鍵因數開始的細胞生長好後的細胞產物合成產物形成期：底物產物酶系統Ⅱ

反應動力學問題

發酵過程的控制一般策略：前期有利於菌體生長，中後期有利用產物的合成溶氧控制的一般策略：前期大於臨溶氧濃度，中後期滿足產物的形成。2、溶氧控制的實例GAXDO谷氨酸發酵：要求：氧飽和度>1控制：0-12小時小通風

12小時後增加通風原因：0-12小時菌體量較小，採用小通風12

一般認為，發酵初期較大的通風和攪拌而產生過大的剪切力，對菌體的生長有時會產生不利的影響，所以有時發酵初期採用小通風，停攪拌，不但有利於降低能耗，而且在工藝上也是必須的。但是通氣增大的時間一定要把握好。例：生產肌苷酸：通氣量不變17.15mg/ml24小時增加22.55mg/ml30小時增加18.25mg/ml36小時增加12.34mg/ml例：某廠青黴素發酵的工藝研究*三、發酵過程中溶氧濃度監控的意義1、考察工藝控制是否滿足要求2、其他異常情況的表徵染菌、噬菌體、設備和操作故障3、間接控制的措施第一節微生物的特性及工業微生物的要求一、微生物的特性

有些微生物能在厭氧的條件下生長

有些微生物能夠利用簡單的有機物和無機物滿足自身的生長

有些微生物能進行複雜的代謝

有些微生物能利用較複雜的化合物

有些微生物能在極端的環境下生長二：工業化菌種的要求

能夠利用廉價的原料，簡單的培養基，大量高效地合成產物

有關合成產物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的可操作性要強

遺傳性能要相對穩定

不易感染它種微生物或噬菌體

產生菌及其產物的毒性必須考慮（在分類學上最好與致病菌無關）

生產特性要符合工藝要求放線菌（鏈黴素四環素；紅黴素等）真菌（青黴素、頭孢等）一些產芽孢的細菌植物或動物來源一、抗生素生產有關的微生物抗生素是次級代謝產物，需要生物體進行複雜的代謝，目前發現的生物來源如下：第二節已工業化產品生產菌的介紹二、氨基酸生產有關的微生物代謝控制發酵：用人工誘變的方法，有意識地改變微生物的代謝途徑，最大限度地積累產物，這種發酵形象地稱為代謝控制發酵，最早在氨基酸發酵中得到成功應用。50,60年代以氨基酸發酵為代表的代謝控制發酵，是發酵工業發展歷史上的一個轉捩點：HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨酸的合成調節機制

HT:高絲氨酸轉乙醯酶AK:天冬氨酸激酶氨基酸生產菌的要求：代謝途徑比較清楚，代謝途徑比較簡單谷氨酸發酵的菌種：其他氨基酸生產菌：棒桿菌屬，短桿菌屬、節桿菌屬或小桿菌屬的棒型細菌常規菌種一般也是以谷氨酸生產菌選育而成；工程菌，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌三、食品酶製劑生產有關的微生物開發一個新酶，都要經過一系列研究的毒理試驗。關於食品用酶，美國需要得到FDA的批准。目前已同意使用的僅僅少數微生物能用於生產食品用酶。α—澱粉酶：黑麯黴、米麯黴、米根酶、枯草牙孢桿菌和地衣牙孢桿菌三、常用的基因表達系統(一)原核生物：大腸桿菌(1977年Boyer)、枯草牙胞桿菌沙門氏菌

生長迅速、蛋白產量高;

表達蛋白的純化、分離及分析快速；

外源基因的導入相對容易；

已建立了整套表達理論及技術.(二)真核細胞表達系統

酵母(既是微生物又是真核細胞)

生長迅速，營養要求不高，易培養；

安全性好；

比哺乳動物細胞操作簡單；

具有一定的修飾蛋白的能力。

中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）表達系統

具有準確的轉錄後修飾功能；

具有產物胞外分越功能，便於下游產物分離純化；

具有重組基因的高效擴增和表達能力；

具有貼壁生長特性，也可進行懸浮生長；

CHO很少分泌自身的內源蛋白。微生物（包括動、植物細胞）幾乎可以生產我們所需的一切產品，但是涉及到工業化生產對於某一種特定的產品，只有特定的微生物才具有大量表達的潛力。問題：生產抗生素的微生物能不能用於生產氨基酸？禮來(Elililly),花了10年的時間從40萬株微生物中，發現了三種有潛力的新抗生素。例：第三節自然界中有目的微生物分離的原則一、菌種分離的一般過程土樣的採取→預處理→培養→菌落的選擇→產品的鑒定如何使樣品中所含微生物的可能性大如何在後續的操作中使這種可能性實現目的：高效地獲取一株高產目的產物的微生物問題：二、採樣時要注意的問題

氣候、水分、空氣

來源要廣

結合產品的特點

標籤：地點、時間、氣候等富集的三種方案：

定向培養:採用特定的有利於目的微生物富集的條件，進行培養。三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：讓目的微生物在種群中佔優勢，使篩選變得可能。

當不可能採用定向培養時，則可設計在一個分類學中考慮，

不能提供任何有助於篩選產生菌的資訊，這時只能通過隨機分離的辦法定向培養的方法物理方法：加熱、膜過濾等，表2-2（P31）但主要是通過培養的方法定向培養的富集方法1、底物2、pH條件3、培養時間4、培養溫度等一切能提高目的微生物相對生長速度的手段，培養（固體、液體；分批連續）後使目的微生物在種群中佔優勢。四、菌落的選出

從產物角度出發在培養時以產物的形成有目的的設計培養基利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素（P35）

從形態的角度

菌落的外觀形態，是微生物的一個重要表徵。如多糖產生菌在適當的培養基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別。實例：鹼性纖維素酶產生菌的篩選（國家七五攻關專案）採樣（造紙廠）→80度30分鐘處理文獻:產生菌為中性牙孢桿菌，嗜堿牙孢桿菌、放線菌及黴菌0.0075%曲利本藍＋1%CMC（羧甲基纖維素），pH10.5培養3～4天，選擇有凹陷圈的菌落從285個土樣中獲得62株26株為組成型36株為誘導型↓例：醛肟水解酶的篩選

--Journalofbiotechnology94(2002),65-72培養基中含0.05%ofZ-PAOx

每隔2-3天移去一半培養物，補充新鮮培養基不斷分析樣品，2-3個月後Z-PAOx降低後，稀釋分離條菌落五、目的微生物富集方法的研究進展

分子生物學的實驗手段，在微生物鑒別及特定目標產物的篩選方面發揮了著越來越重要的作用。如:16SRNA同源性分析，基因序列分析及DNA/DNA雜交技術等

目前土壤中能夠培養的微生物不到總數的1%。微生物的多樣性及資源的開發仍然是今後若干年的研究重點。

2002,陳文新（科學院院士）

Incontrasttothistraditionalapproach,modernmolecularbiologytechniquesallowforDNAlibraryexpressionscreening,whichalsoenablesaccesstoenzymesof`nonculturable'organisms.Bythisstrategy,forinstance,thecompanyDiversa(SanDiego,CA,USA)identised120uniqueesterases/lipasesfromonly16%ofthetotalDNAobtainedfromanalkalinesoilsample.FEMSMicrobiologyReviews26(2002)73～81第四節菌株選育、分子改造目的

提高生產能力

提高產品品質

開發新產品

解決生產實際問題

防止菌種退化方法基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質體融合、基因工程基因的直接進化：點突變、易錯PCR、同序法DNAShuffling等自然狀態下，堿基對發生自然突變的機率為10-8～10-9自然突變有兩種情況：一種是我們生產上所不希望看到的，表現為菌株的衰退和生產品質的下降，這種突變成為負突變。另一種是我們生產上希望看到的，對生產有利，這種突變成為正突變。一、自然選育自然選育在工業生產上的意義自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠保證穩產高產的重要措施。回復突變：高產菌株在傳代的過程中，由於自然突變導致高產性狀的丟失，生產性能下降，這種情況我們稱為回復突變問題：高產菌株是正突變高，還是負突變高？自然選育操作步驟：一般習慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。單細胞(孢子)懸液的製備平板分離挑選單菌落(注意形態的觀察)發酵試驗二、誘變育種用各種物理、化學的因素人工誘發基因突變進行的篩選，稱為誘變育種誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質稱為誘變劑誘變劑物理在：紫外，快中子化學：硫酸二乙酯，亞硝基胍{（二）、誘變劑處理過程中幾個有關的問題

化學誘變劑使用過程的安全性誘變劑量的選擇誘變劑的選擇出發菌株的選擇（一）、誘變劑的作用原理（略）壓硝酸：0.07MNa2HPO4亞硝基胍：1MNaOH（三）、誘變育種的一般步驟(p83)（四）、篩選的方法

隨機篩選

形態

理性化篩選從產物形成的生理生化途徑著手，進行有的放矢的篩選。如結構類似物抗性、營養缺陷型等，篩選而產生的這些特性，稱為遺傳標記。結構類似物：在化學和空間結構上和代謝的中間物（終產物）相似，因而在代謝調節方面可以代替代謝中間物（終產物）的功能，但細胞不能以其作為自身的營養物質。HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸的合成調節機制

HT:高絲氨酸轉乙醯酶AK:天冬氨酸激酶結構類似物抗性：Lys的類似物AEC,Thr的類似物AHV營養缺陷型：如Thr缺陷型黃色短桿菌F9-50的誘變譜系BervibacteriumflavumAs1.495(leu-)lys.HCl2.1g/lF6-16(leu-,Thr-)20.8g/lF9-50(leu-,Thr-,AECr)33.5g/l三、基因的直接進化(directedevolution)

突變基因突變庫的建立篩選基因突變庫的篩選基因複製與遺傳步驟：

在分子水準上，對目標基因直接處理，然後通過高通量的篩選方法，提高目標蛋白的性能。主要應用：酶學性能的提高:pH

溫度

有機溶劑生理環境→工業催化環境

底物專一性脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯例：PLAPLA光學拆分選擇性(%)231577581905次錯位PCR2次定點突變Reetz(1997)Liebeton(2000)第二章菌種的來源定點突變錯位PCRDNAShuffling:指DNA分子的體外重組，是基因在分子水準上進行有性重組(SexualRecombination)。XXXX

XXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXXX

XXX

XXXX

XXXX

XXX

XXXXXXXXXXXXXXXX

FragmentReassembleSelectbestwithDNAseIfragmentsrecombinantsRepeatformultiplecyclesDNAshuffling專案進化速度進化對象進化週期影響對象突變效率常規定向進化緩慢進化整個基因組多年完整基因組低DNAShuffling快速進化特定基因/操縱子/病毒幾天部分基因組高DNAShuffling與常規定向進化的比較類型示例特性活性增加倍數潛在應用領域抗體人源抗體親和性400生物制藥酶天冬氨酸轉氨酶催化特異性10，000生物制藥β-內醯胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草桿菌蛋白酶E耐熱性65℃耐熱時間17200工業酶細胞因數人類干擾素抗病毒285，000基因治療腫瘤抑制因數P5337℃半衰期12基因治療代謝途徑砷酸鹽代謝途徑砷酸鹽解毒40生物制藥汞代謝途徑汞解毒12生物制藥部分DNAShuffling技術的研究成果滅菌：指用化學或物理的方法殺滅或去除物料及設備中所有生命物質的技術或工藝過程。

第一節滅菌的原理及方法一幾種常見的滅菌方法1化學物質滅菌原理：藥物與微生物細胞中的成分反應，使蛋白質變性酶失活。常用的滅菌劑:使用範圍：器皿、雙手和實驗室、無菌室的環境滅菌，不能用於培養基滅菌

常用的滅菌劑化學物質名稱有效濃度化學物質名稱有效濃度新潔爾滅(苯紮溴銨)0.25%甲醛37%杜滅芬0.25%戊二醛2%高錳酸鉀0.1%-0.25%苯酚0.1%-0.15%漂白粉5%過氧乙酸0.02%-0.2%酒精75%焦碳酸二乙酯0.01%-0.1%煤酚皂（來蘇爾）1%—5%

*2.

輻射滅菌原理：利用高能量的電磁輻射與菌體核酸的光化學反應造成菌體死亡。

常用：紫外線、X射線和γ射線。

使用範圍：用於室內空氣及器皿表面滅菌

3．幹熱滅菌

原理：利用高溫對微生物有氧化、蛋白質變性和電解質濃縮作用而殺滅微生物。常用方法：灼燒和電熱箱加熱，140-180℃1-2小時使用範圍：玻璃及金屬用具及沙土管滅菌4．濕熱滅菌

原理：蒸汽冷凝放出大量潛熱，具有穿透力，且在高溫有水分條件下，蛋白質易變性。常用方法：水煮常壓滅菌：100℃飽和蒸汽滅菌：一般121℃，30分鐘使用範圍：培養基和發酵設備滅菌。

5．過濾除菌

原理：利用微生物不能透過濾膜除菌。方法:0.01~0.45

m孔徑濾膜，使用範圍：用於壓縮空氣、酶溶液及其他不耐熱化合物溶液除菌。

二.濕熱滅菌原理

1.生物熱死動力學（對數殘存定律）

dN/dt=-KN

N：菌體個數（個）

t:滅菌時間（min）k：反應速度常數（min-1）dN/dt:菌受熱死亡速率(個/min)LnN/N0=-KtN=N0e-Kt以菌的殘留數LnN/N0的對數與時間t作圖，得出一條直線，其斜率為-K（P222圖14-1）

如何通過實驗根據對數殘存定律確定某一溫度,某一微生物的K？1).K與菌種的特性有關相同溫度下，微生物越耐熱，k值越小。相同溫度下，微生物越不耐熱，k值越大。

2.反應速率常數K

2).K與滅菌溫度有關K=Ae–E

/RT（阿累尼烏斯方程）LnK=LnA-E/RTA：比例常數R：氣體常數(J/molK)T：絕對溫度(K)△E：殺死細菌所需的活化能（J/mol）121℃118℃115℃110℃105℃

第二節培養基和發酵設備的滅菌工藝

一．培養基滅菌時間的選擇t=1/k*Ln(N0/N)

其中K：一般耐熱的細菌芽孢的K值

N0：細菌及芽孢數之和

N：10-3二.培養基滅菌溫度的選擇

選擇即能達到滅菌要求，

又保證營養成分不被破壞的溫度1.培養基營養成分破壞動力學方程-dC/dt=K’C-dC/dt:營養物降解速度mol/LhC:營養物濃度mol/LK’:

營養物降解反應速度常數1/st：時間(S)Ln(C/C0)=-K'tK’=

A’e-E’/RT

LnK’=LnA’-E’/RTA’：比例常數R：氣體常數(J/molK)T：絕對溫度(K)E’：營養物破壞所需的活化能（J/mol）2.根據實驗結果滅菌活化能大於培養基破壞活化能E＞E’P225表14-113.滅菌反應

營養物破壞反應

T1 LnK1=LnA-E/RT1 LnK1’=LnA’-E’/RT1T2LnK2=LnA-E/RT2 LnK2’=LnA’-E’/RT2Ln(K2/K1)=E/R(1/T1-1/T2)Ln(K2’/K1’)=E’/R(1/T1-1/T2)Ln(K2/K1)=ELn(K2’/K1’)E’Ln(K2/K1)＞Ln(K2’/K1’)K2/K1＞K2’/K1’

當溫度升高時微生物死亡速度常數比營養物質降解速度常數變化得大4．達到相同滅菌效果，T越高，K越大，所需t越短，採用高溫短時（HTST）滅菌效果好

三影響滅菌效果的因素微生物種類：不同的微生物k值不同。初始菌量：在保持N值不變的前提下，t與初始菌量N0的對數成正比。培養基成份：油脂、蛋白質增加微生物的耐熱性。傳熱與混合狀況：影響受熱均勻度。培養基中固體顆粒的存在影響熱穿透。蒸汽中空氣的存在降低蒸汽分壓和滅菌溫度。pH：酸性pH下可加快微生物熱死速率

四.培養基和發酵設備的滅菌方法

（一）實驗室種子培養基滅菌方法使用高壓蒸汽滅菌鍋

手提式滅菌鍋。容量小。立式或臥式滅菌鍋。容量較大，一般能裝幾十瓶或幾百瓶。滅菌櫃。要和蒸汽鍋爐配套，用於大量種瓶培養基的滅菌，一次能裝幾百至幾千瓶(袋)。四.培養基和發酵設備的滅菌方法

（二）分批滅菌(batchsterilization)1．定義：將配製好的培養基輸入發酵罐中，用蒸汽加熱，使培養基和設備同時滅菌的一種滅菌方式。2．操作過程：空罐準備：清洗、檢修和檢測。升溫：把培養基加熱到滅菌所需的溫度。保溫維持：在滅菌溫度下保持滅菌所需時間。冷卻保壓：把培養基的溫度降低到接種的溫度。溫度隨滅菌時間的變化三路進汽：直接蒸汽從通風、取樣和出料口進入罐內直接加熱，直到所規定的溫度，並維持一定的時間。這就是所謂的“三路進氣”。

*四路出汽：直接蒸汽從排氣、接種、進料和消沫劑管排氣分批滅菌設備示意圖

三）連續滅菌(continuoussterilization)1．定義：將培養基通過專門設計的滅菌器，進行連續流動滅菌後，進入預先滅過菌的發酵罐中的滅菌方式。

2．流程：

1)由熱交換器組成的滅菌系統

2)蒸汽直接噴射型的連續滅菌系統

3）由連消塔、維持罐和噴淋冷卻組成的滅菌系統

由熱交換器組成的滅菌系統工藝流程圖溫度隨時間的變化蒸汽直接噴射型的連續滅菌系統溫度隨滅菌時間的變化由連消塔、維持罐和噴淋冷卻組成的滅菌系統三）連續滅菌與分批滅菌的比較與選擇分批滅菌優點：1．不需附加設備2．

蒸汽利用率高3．

節約勞動力

缺點1．

培養基品質比較差2．

罐的利用率低3.冷卻水用量大連續滅菌優點：1採用高溫快速滅菌法2．可以把培養基按其性質分開滅菌3．有利於自動控制4．節省冷卻水缺點1．

投資費用高2．

對物料要求高3．

蒸汽用量大選擇原則：

1．

培養基成份（易降解成分、液化情況等）

2．

設備狀況（冷卻面積、傳動裝置等）

3.動力條件四、高溫對培養基成分的有害影響及其防止

消除高溫有害影響的措施（1）採用特殊加熱滅菌法(連續滅菌方法）（2）對易破壞的含糖培養基進行滅菌時，應先將糖液與其他成分分別滅菌後再合併；（3）對含Ca2+或Fe3+的培養基與磷酸鹽先作分別滅菌，然後再混合，就不易形成磷酸鹽沉澱；（4）對含有在高溫下易破壞成分的培養基（如含糖組合培養基）可進行低壓滅菌

第三節空氣除菌一、無菌空氣的要求1.空氣中的微生物空氣中的微生物種類以細菌和細菌芽孢較多，也有酵母，黴菌孢子和病毒。這些微生物大小不一，一般附著在空氣中的灰塵上或霧滴上，空氣中微生物的含量一般為103~104個／米3。灰塵粒子的平均大小約0.6μm左右，所以空氣除菌主要是去除空氣中的微粒(0.6-1μm）第三節空氣除菌一、無菌空氣的要求無菌空氣的標準百分數：99.99％美國聯邦宇航局等級標準：100級（直徑小於0.5微米粒子數少於3.5個/L）溫度：25℃—40℃濕度：30%—45%

1.

纖維或顆粒介質填充床篩檢程式：棉花、玻璃纖維、腈綸、滌綸、維尼綸或活性炭等

2.折疊式硼矽酸超細纖維篩檢程式：超細玻璃纖維

3.燒結金屬、陶瓷篩檢程式

二介質除菌：原理：過濾介質填充到篩檢程式中，空氣流過時借助慣性碰撞、阻截、擴散、靜電吸附、沉降等作用將塵埃微生物截留在介質中，達到除菌的目的。主要設備：填充床篩檢程式發酵生產中製備無菌空氣的大致過程

空氣介質除菌流程高空取氣管是遠離地面幾十米的管子。一般而言，地面附近空氣中所含的微生物和灰塵等均比高空空氣中含的多，據資料介紹，每升高10米，空氣中雜菌可降低一個數量級，因此從高空取氣要比從低空取氣有利得多。兩級分離、冷卻、加熱的空氣除菌流程

１——粗篩檢程式２——壓縮機３——貯罐４——冷卻器

５——絲網分離器６——篩檢程式

高效前置過濾除菌流程

１——高效前置篩檢程式２——壓縮機３——貯罐４——冷卻器

５——絲網分離器６——加熱器７——篩檢程式

第一節染菌的檢查與判斷

一、雜菌污染的檢查

培養基（1）細菌培養基營養肉湯：glucose10g,peptone5g,beefextract5g,NaCl5g,distilledwater1000ml,pH7.2~7.4。酚紅肉湯：營養肉湯+1%phenolred3ml。營養瓊脂：glucose5g,peptone10g,beefextract3g,NaCl5g,agar15~20g,distilledwater1000ml,pH7.2~7.4。2）酵母培養基

薩氏培養基（Sabouraud’sagar）：glucose40g,peptone10g,agar15~20g,distilledwater1000ml,pH5.6。（3）黴菌培養基察氏培養基（Czapek’sagar）：sucrose30g,NaNO33g,K2HPO41g,MgSO4

7H2O0.5g,KCl0.5g,agar15~20g,distilledwater1000ml,pH6.6。無菌檢查的流程：取樣接入試管或斜面培養（細菌32~37℃，1~2天；真菌25~28℃，1~3天）肉眼檢查鏡檢二、通過異常現象判斷溶解氧水準異常變化顯示染菌發酵時間溶氧濃度正常發酵污染噬菌體發酵時間溶氧濃度正常發酵污染好氣性雜菌污染非好氣性雜菌排氣中CO2異常變化顯示染菌二、通過異常現象判斷工藝一定，尾氣中CO2量變化有一定規律污染雜菌，糖耗加快，尾氣中CO2量增加污染噬菌體，糖耗減慢，尾氣中CO2量減少種子系統空氣帶菌設備滲漏培養基滅菌不徹底操作失誤第二節染菌原因的分析

從染菌規模分析大規模染菌空氣淨化系統種子染菌、接種管道滲漏部分罐批染菌某一批號種子染菌某一套連消系統染菌補料管路滲漏或補料液帶菌個別罐批連批染菌設備問題個別罐不連批染菌培養基滅菌不徹底或操作失誤早期染菌培養基滅菌不徹底種子帶菌接種管道滅菌不徹底或接種操作不當中期染菌培養基滅菌不徹底加消沫劑、補料系統滅菌不徹底或滲漏發酵設備滲漏泡沫頂罐後期染菌空氣系統有問題從染菌時間分析酵母菌：種子室、搖瓶間、計量罐、進料補料閥門、攪拌軸封、被倒流的空氣介質黴菌：種子室、搖瓶間、攪拌軸封、被倒流的空氣介質、空氣普通桿菌：空氣過濾介質、冷水設備滲漏、設備死角滲漏芽孢桿菌：培養基滅菌不徹底、設備有死角球菌：空氣系統、無菌間搖瓶間空氣中從染菌的菌型分析第三節染菌的防治措施

一、一般染菌的防治預防種子帶菌：

環境清潔，無菌操作設備完好、可靠，無菌操作用品滅菌徹底，操作熟練，制度嚴格。一、一般染菌的防治消滅培養基染菌：

嚴格物料採購、運輸、倉貯配料（防止塊狀物料、清洗配料罐）滅菌（保證蒸汽的壓力、穩定及暢通、按操作規程操作）保壓（防治培養基倒流）

嚴防空氣帶菌：提高空氣進口的潔淨度除盡壓縮空氣中的油和水空氣篩檢程式滅菌時防止被沖翻保證空氣篩檢程式介質的填裝品質一、一般染菌的防治杜絕設備污染：良好的設計（無死角）規範的安裝徹底的清洗嚴密的維修有效的滅菌。一、一般染菌的防治染菌罐的處理種子罐染菌滅菌後放下水道並對種子罐、管道進行檢查和滅菌啟用備用罐或倒種

發酵灌染菌前期：危害大的滅菌後放下水道危害不大，可重新滅菌，重新接種中後期：降低培養溫度，降低通風提前放罐控制補料量染菌罐的處理二、噬菌體污染的防治

噬菌體污染的鑒別

現象鑒別：發酵液變稀、發粘，OUR

，DO

，NH4+—N

，泡沫

。平板鑒別：觀察噬菌斑。污染的預防

選育抗噬菌體菌株；

環境、明溝、下水道定期消毒；

排氣過濾，菌體排放前滅菌；

選用孔徑為0.01

m的微濾膜空氣篩檢程式；

發酵車間遠離農田、排汙明渠、污水處

培養基中加入適量化學消毒劑：三聚磷酸鈉0.2%~0.3%，植酸0.1%~0.2%，檸檬酸0.2%~0.5%，草酸0.2%~0.5%，新潔而滅0.02%~0.05。

生產菌種的必備條件：1生長快：2對環境條件要有比較大的承受能力3遺傳表現型要穩定，不易退化4菌種要純斜面沙土管冷幹管液氮管實驗室種子製備生產現場種子製備生產種子製備的一般流程

二級斜面一級斜面米孢子母瓶

子瓶一級種子罐發酵罐

二級種子罐三級種子罐菌種保藏幾個概念種子罐級數：種子在種子罐中需擴大培養的次數。發酵級數：種子罐的級數加一。接種量：放罐的種子罐的培養液體積除以接種後培養液的體積的百分數。種齡：生產種子的培養時間。一斜面種子的製備

1.斜面種子：在試管或扁瓶內，以瓊脂固化的培養基表面上生長的菌種培養物。2.製備流程：3.製備過程注意事項

(1)

瓊脂要完全浸沒在營養液內,用量1.0%-2.5%(2)營養液中最好不含易沉澱的固形物；

(3)裝量掌握在斜面頂端