大肠杆菌和布鲁氏菌脂多糖刺激条件下巨噬细胞差异表达miRNAs的鉴定及其作用机制

大肠杆菌和布鲁氏菌脂多糖刺激条件下巨噬细胞差异表达miRNAs的鉴定及其作用机制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是大肠杆菌、布鲁氏菌等革兰氏阴性菌细胞壁的一种成分,可诱导单核／巨噬细胞活化、成熟,通过刺激单核／巨噬细胞产生并释放大量的一氧化氮(nitricoxide,NO)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及肿瘤坏死因子-a(tumornecrosisfactor-a,TNF-a)等炎症因子,引起宿主产生炎症反应,严重时可诱发脓毒症、脓毒性休克,导致多器官功能障碍,甚至发生脓毒性死亡。MicroRNAs(miRNAs)是一类大小约为18-24个碱基的非编码单链小分子RNA,主要通过与靶基因mRNA分子的3’端非编码区域(3’untranslatedregions,3’UTR)互补匹配,导致靶基因mRNA分子的被切割或翻译受到抑制,实现转录后水平的基因表达调控。目前,对LPS的研究主要集中在信号通路、细胞因子分泌,以及其所引起的器官损伤和细胞凋亡等方面。我们通过分析大肠杆菌LPS(EscherichiacoliLPS,E.coliLPS)和布鲁氏菌LPS(BrucellamelitensisLPS,B.melitensisLPS)刺激条件下,巨噬细胞差异表达的miRNAs及其对于靶基因的调控,以在表观遗传学层面揭示E.coliLPS和B.melitensisLPS诱导宿主发生炎症反应的分子机制。方法1)利用TaqManMicroRNAArray检测E.coliLPS刺激后RAW264.7细胞miRNAs表达谱变化,并用qRT-PCR对差异表达的miRNAs进行验证；2)应用生物信息学方法对差异表达miRNAs的靶基因进行预测,并利用GeneOntology对所预测的基因进行功能分类；3)E.coliLPS和B.melitensisLPS刺激RAW264.7细胞后,应用qRT-PCR检测miR-27a-5p时间变化曲线,并结合Westernblot检测E.coliLPS和B.melitensisLPS刺激RAW264.7后差异表达的]miR-27a-5p的预测靶基因的表达；4)将甘油醛一3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)和经过qRT-PCR和Westernblot验证过的miR-27a-5p的靶基因单核细胞趋化蛋白诱导蛋白1(monocytechemotacticproteininducedprotein1,MCPIP1)的3’UTR克隆到pmirGLO萤光素酶报告基因载体中,并与miR-27a-5p模拟物共转染到HEK293细胞中,通过双萤光素酶报告基因检测系统检测萤光素酶表达,分析miR-27a-5p与MCPIP13’UTR的相互作用情况；5)在RAW264.7细胞中过表达MCPIP1,应用ELISA方法检测RAW264.7细胞在E.coliLPS和B.melitensisLPS刺激条件下IL-6、IL-10和IL一1β的分泌。结果1)通过TaqManMicroRNAArray分析,与空白对照组比较,在E.coliLPS刺激后,RAW264.7细胞中有7条miRNAs差异表达,其中miR-196b,miR-196c,miR-146a,miR-155和miR-222表达上调,而miR-27a-5p和niR-532-5p表达下调。qRT-PCR验证结果表明,E.coliLPS刺激RAW264.7细胞后,miR-146a和miR-155表达上调,miR-27a-5p和miR-532-5p表达下调。B.melitensisLPS刺激RAW264.7细胞后,可引起miR-146a,miR-155和miR-532-5p表达上调,以及miR-27a-5p表达下调；2)通过TargetScan,PicTar,miRDB和microRNA.org四个数据库对差异表达miRNAs靶基因进行预测,获得1000多个靶基因,由于LPS的主要作用是引起巨噬细胞炎症反应,所以使用GeneOntology对靶基因进行分类,并对炎症相关基因进行富集,得到涉及炎症反应、细胞凋亡、细胞因子介导的信号转导、免疫反应、细胞因子的产生和先天免疫反应的靶基因39个；3)在E.coliLPS和B.melitensisLPS刺激RAW264.7细胞后的不同时间点,应用qRT-PCR对miR-27a-5p的表达水平进行分析,结果表明,E.coliLPS和B.melitensisLPS刺激可引起miR-27a-5p表达降低,应用qRT-PCR和Westernblot对E.coliLPS和B.melitensisLPS刺激RAW264.7细胞后靶基因的表达水平进行检测,结果表明,在miR-27a-5p的预测靶基因中,MCPIP1mRNA表达水平在E.coliLPS刺激6h后显著升高,MCPIP1蛋白表达在E.coliLPS刺激3h后逐渐增加,在6-12h间高表达,到24h时,蛋白表达基本恢复到未刺激水平。而B.melitensisLPS对MCPIP1表达无显著影响；4)萤光素酶报告基因实验结果表明,与共转染Pre-miR-NC无效序列相比,pmir-luciferase-MCPIPl-3’UTR与Pre-miR-27a-5p共转染HEK293细胞,可以显著抑制萤光素酶活性,提示miR-27a-5p可以与MCPIP13’UTR特异性结合抑制其表达；5)在RAW264.7细胞中过表达MCPIP1后,应用ELISA方法对细胞因子分泌进行检测,结果表明,在E.coliLPS和B.melitensisLPS刺激条件下,MCPIP1过表达可显著降低RAW264.7细胞IL-6、IL一10和IL-lp的分泌。结论本研究分析了E.coliLPS和B.melitensisLPS刺激条件下RAW264.7细胞miRNAs的表达,筛选到4条差异表达的miRNAs,其中,miR-27a-5p在E.coliLPS和B.melitensisLPS刺激条件表达均下调,miR-155和miR-146a表达均上调。miR-532-5p在E.coliLPS刺激条件表达下调,而在B.melitensisLPS刺激条件下表达上调；通过生物信息学软件(TargetScan、PicTar、miRDB和microRNA.org)预测,获得差异表达的miRNAs的1000多个候选靶基因。并对涉及炎症反应、细胞凋亡、细胞因子介导的信号转导、免疫反应、细胞因子的产生和先天免疫反应的等炎症相关靶基因进行富集,得到39个炎症相关靶基因。通过qRT-PCR分析,我们发现,在E.coliLPS和B.melitensisLPS刺激条件下,RAW264.7细胞中miR-27a-5p表达下调,Westernblot验证了其靶基因MCPIP1在E.coliLPS刺激条件下表达上调。通过萤光素酶实验,证实了miR-27a