大白菜成花转变基因筛选及内源激素变化研究

大白菜成花转变基因筛选及内源激素变化研究大白菜(Brassicarapasubsp.pekinensis)品种间冬性强弱差异很大,弱冬性品种的先期抽薹是影响收益的重要原因,而强冬性品种则存在制种困难,因此,研究大白菜的成花机理具有非常重要的理论和实践意义。尽管目前已有一些关于大白菜花期分子调控的研究报道,但与拟南芥相比,在成花分子机制上的研究深度和广度仍有很大差距。大白菜基因组测序的完成和基因注释的不断完善以及高通量测序技术的广泛应用为大白菜成花机理的研究提供了一个新的手段。本研究以大白菜为试材,建立了最佳开花系统;利用高通量测序技术对大白菜未经低温处理(CK1)、低温处理后花芽即将分化(V1)、花芽分化1级(V2)的茎尖进行测序,以筛选与成花相关的基因;克隆LFY同源基因并分析可变剪接类型及表达模式；分析成花各时期生长素、茉莉酸、赤霉素、玉米素和脱落酸的含量变化,明确各激素在成花过程中的作用,以期进一步完善大白菜成花调控的分子机理。主要研究结果如下：1.比较4个大白菜品系‘3#’、‘7#’、‘8#’和‘9#’在4℃低温处理10d、20d和30d下的现蕾开花情况,发现随着低温处理时间的增加,各品系开始花芽分化、现蕾以及开花的时间均有所减少,对应时期的叶片数也随之减少。4个品系间的冬性差异显著,‘9#’冬性最强,‘8#’次之,‘3#’和‘7#’则较弱。综合分析,‘3#’和‘7#’品系适宜作为大白菜成花机理研究的材料,低温处理时间以20d为宜；如果选择耐抽薹的品系进行比较研究,可选用‘9#’,但要低温处理30d以上才能使其通过春化。2.利用高通量测序技术对CK1、V1和V2这3个茎尖样品进行了测序,经基因表达比较分析,CK1_vs_V1中共获得1680个DEGs,其中780个上调,900个下调。对DEGs进行GO功能分析,发现在细胞组分注释中,富集条目主要集中在叶绿体各组分;在分子功能注释中,富集条目主要集中在各氧化还原酶活性上;在生物过程注释中,富集条目主要集中在一些与成花有关的因素上,如蓝光响应、远红光响应、蔗糖响应、水杨酸及茉莉酸介导的信号通路和MAPK级联等。对DEGs进行KEGG通路分析,结果表明黄酮类化合物和芥子油苷在成花过程中具有重要作用。3.将已经公布的大白菜成花相关基因与表达谱比较,有10个基因差异表达,且大部分基因的表达与预测一致,说明测序结果可信。有4个高差异表达基因的表达变化趋势与成花功能描述一致,分别为促进成花的Bra000180、Bra009813和抑制成花的Bra024350、Bra026653,预测它们在大白菜中也具有相似的功能,可进行进一步的研究。4.克隆得到2条LFY同源基因序列,开放阅读框分别为1248bp和1260bp,分别命名为BrpLFYl和BrpLFY2,并上传序列至NCBI,GenBankaccessionnumber为KR190435和KR190436。经可变剪接分析,发现二者是BrpLFY的不同可变剪接体,之所以相差12bp是因为在第二外显子处发生了可变5’端剪接,其中一个保留了12bp的第一内含子序列。通过PCR扩增发现在不同品系大白菜的不同发育时期,各组织中都几乎只有BrpLFY2的表达,这一结果与可变剪接表达量的分析结果一致,推测在大白菜成花过程中起主要作用的是BrpLFY1。o5.采用荧光定量PCR分析BrpLF哟时空表达模式,结果表明,BrpLFY基因在大白菜的各组织中均有表达。在茎尖生长点中的表达量随着生长发育的进行逐渐升高,在花芽分化开始时表达量骤升,并在5级时达到顶峰,而后开始下降,无论春季生长还是秋季种植冬储过程均为如此,但在强冬性品种中的表达高峰更高,推测强冬性品种需要更高的BrpLF表达才能诱导成花。比较BrpLFY在不同组织器官中的表达,在花芽分化5级时,幼叶最高,成熟叶和生长点次之,根最低,另外在花蕾和花中的表达也较少。BrpLFY在花芽分化的幼叶和成熟叶中的表达量显著高于其它组织,推测该基因在叶片的生长过程中也发挥了某些作用。6.采用ELISA法测定了‘7#’大白菜低温处理组和对照组植株发育各时期茎尖生长点中IAA、JA、GA1+3、Z+ZR和ABA的含量,低温处理组中各激素的含量变化结果表明,在一定范围内较高含量的IAA、JA和GA1+3有利于大白菜成花转变,而抽薹现蕾则需要较高含量的IAA、JA和Z+ZR,在花芽分化3级时各激素含量较低,说明在分化进程中可能有一个短暂的停歇。此外,通过KEGG代谢通路分析,筛选到导致IAA、JA、Z+ZR和ABA在成花过程发生含量变化的主要基因。与对照植株相比,大白菜成花过程需要较高比值的GA1+3/IAA、Z+ZR/IAA、ABA/IAA、GA1+3/Z+ZR、ABA/GA1+3和ABA/Z+ZR。在低温处理组中,一定范围内较高比值的GA1+3/IAA、Z+ZR/IAA、ABA/IAA、JA/IAA、JA/GA1+3、JA/Z+ZR和JA/ABA有利于成花转变,而较低比值的JA/IAA、JA/GA1+3、JA/Z+ZR和JA/ABA有利于分化进程,抽薹现蕾则需要较低比值的GA1+3/IA