男科实验室检查及质控临床技术操作规范

男科实验室检查及质控临床技术操作规范男性不育与精液（semen）质量密切相关，精液由精浆（seminalplasma）和精子（sperm）组成，在射精时由睾丸和附睾的分泌液及悬浮其中的精子与前列腺、精囊腺和尿道球腺的分泌物混合而成。精液分析是评估男性生育能力的重要方法，也是男科疾病诊断、疗效观察的实验依据，但精液分析的各参数也不是特异的，它并不能够确定到达受精位置的少数精子的受精能力，因此要正确地评价男性生育能力还需要结合临床进行综合评估（表16-1)。表16-1精液分析的正常参考值WH0第4版参考值WH0第5版参考值精液体积≥2.0ml≥1.5mlpH7.2-8.0≥7.2液化时间60min黏稠度精液液化后的拉丝≤2cm精子浓度≥20x106/ml≥15x106/ml精子活力a级精子25%,或a+b级精子50%PR≥32精子活动率≥60%PN+NP≥40%正常形态精子百分率≥15%≥4%精子存活率≥75%≥58%精浆中性葡糖苷酶35.1-87.7U/ml≥20mU/一次射精精浆果糖0.87-3.95g/L≥13/一次射精精浆锌0.8-2.5mmol/L≥2.4umol/一次射精低渗膨胀率≥70%≥58%顶体完整率≥75%白细胞计数1x106/ml免疫珠试验10%50%MAR试验10%50%第一节精液标本采集一、精液采集前准备精液采集与分析必须严格按照标准化程序进行，才能提供受检者的准确信息。精液采集规范化是做好精液分析的前提条件，在精液采集前应告知受检者有关精液采集和运送的方法及注意事项。精液标本采集须禁欲2-7d。如需多次采集标本，每次禁欲天数尽可能一致。精液标本采集必须完整，如果标本不完整，受检者要报告精液标本任何部分的丢失情况，尤其是含精子浓度最高的初始部分精液，以免影响精子浓度的测定，并在报告中注明。由于精液分析受多种因素的影响，不能凭一次的精液结果作出判断，应间隔1-2周进行2次或3次以上的分析。如果两次的结果有明显的差异，应再进行分析。二、精液标本的采集方法1.采集精液推荐使用手淫采集，如有困难可用仪器辅助。用对精子无毒性作用的广口玻璃杯或塑料容器收集精液，温度保持在25-37℃，以避免降低精子活力。精液采集一定要完全，不完整的精液不宜进行分析。2.禁用性交中断法采集精液，这种方法容易造成丢失精液的前一部分。如手淫取精有困难，可用特制的避孕套进行精液采集，不能用市售乳胶或塑料制品的避孕套，因为避孕套内含有杀精剂。3.为避免精液暴露于温度波动的环境和控制从采集到检测的时间，安排靠近实验室的私密房间采集标本。推荐用手淫的方法采集精液，取精前洗净双手和阴茎。充分勃起阴茎并尽量兴奋，将精液全部射人指定容器中，如确有困难可选择以下方法进行:家中样本采集;避孕套采集，只能用经特殊设计对精子没有毒性的避孕套来采样。以上受检者应记录采集的时间，并在1h内送至实验室。在送至实验室途中样本应保持在20-37℃的环境中。4.进行微生物检测精液样本的采集:须避免来自精液以外的污染，受检者需按下列步骤进行:排尿;用肥皂清洗手和阴茎;冲去残留肥皂;用无菌毛巾擦手和阴茎;精液射人无菌容器中。精液样本的收集至实验室微生物操作开始的时间不超过3h。淋球菌对温度和氧气敏感，精液标本应在20min之内检查。5.精液标本采集后记录采集时间，并注明患者姓名、采集日期和时间、禁欲时间、标本采集是否完整、标本采集过程中的困难以及标本从采集到分析的时间间隔等，标本应尽量在1h内检测，一定不能超过2小时检测，液化时间观察应在精液标本采集后就开始。精液标本采集后在实验室存放或在转送过程中，其温度应保持在25-37℃，温度过高或过低都会影响精子活力。6.生物安全:精液是潜在的传染源，精液标本应视为生物危险品，其可能含有有害的感染物质，如HIV、HBV、HsV等，操作者应注意自身安全防护。第二节精液常规分析精液常规检查包括精液体积、液化时间、酸碱度、黏稠度、精子浓度、活力和活率分析等。一、精液外观刚射出的精液通常为灰白或淡黄色，自行液化后为半透明乳白色或淡黄色的均质、半流体液体。长时间未排精的精液为淡黄色或暗黄色，黄疸患者和服用维生素或某些药物者的精液可呈黄色。药物可使精液带有颜色。如果混有大量红细胞颜色可为红色，称为血精，常见于精囊炎、前列腺炎等生殖系统疾病，也可见于苗勒管囊肿、结石、肿瘤如前列腺癌、输精管的微小损害等。二、精液体积WH0推荐称重法和直接测量法进行精液体积测定，首选称重法，精液的密度变化范围大致在1.043-1.102g/ml。不推荐使用目测法检测精液体积。三、液化时间精液射出后很快呈典型的半固体凝胶团块，通常在几分钟内便开始液化，通常室温15min内精液标本可完全液化，很少超过60min。超过60min未液化，称为精液迟缓液化或精液液化异常。不液化精液按如下方法处理。1.加人等体积的Dulbeco磷酸缓冲液，并反复吹打，可使某些精液标本液化。Dulbeco磷酸盐缓冲液配制:①Dulbeco葡萄糖-PBs:0.2g氯化钾（KCl)、0.2g磷酸二氢钾 （KH2P04)、0.1g氯化镁（MgCl2.6H20)、8.0g氯化钠（NaCl)、2.16g磷酸氢二钠（Na2HP04.7H20)和1.0gD-葡萄糖加人到750ml蒸馏水中。②将0.132g氯化钙（CaCl2.2H20）溶于10ml蒸馏水中，边搅拌边缓慢加人上述溶液中。③用1mol/LNa0H调节pH至7.4。④用蒸馏水定容至1000ml。2.精液反复缓慢地通过接在注射器上的18号或19号钝性针头，可降低精液的非均匀状态。3.应用广谱蛋白水解酶—菠萝蛋白酶消化，有助于促进精液液化。以上处理可能影响精浆生化、精子活力和精子形态分析，应记录相应操作。精液液化不全常见于前列腺疾病，特别是与前列腺炎有关。四、pH推荐使用精密pH试纸检测，在精液液化后立即测定，精液放置时间长会影响pH测定。将一滴混匀的精液在pH精密试纸上均匀展开，待浸渍区颜色变得均匀（30s内)，读取pH。五、黏稠度用滴管吸人精液或玻棒插入精液，让精液依靠自身重力滴落并观察拉丝的长度，正常精液形成不连续的小滴，拉丝长度大于2cm视为异常。黏稠度增加处理方法同液化不全。六、精子凝集精子凝集特指活动精子以不同方式，如头对头、头对尾、尾对尾或混合型，彼此粘在一起的现象。不活动精子之间、活动精子与黏液丝之间、非精子细胞成分或细胞碎片等粘在一起，为非特异性聚集而非凝集。凝集提示可能存在抗精子抗体，但不足以说明不育是免疫因素引起的，需进一步实验证明。精子凝集程度:1级:零散的，每个凝集10个精子，有很多自由活动精子。2级:中等的，每个凝集精子数为10-50个，存在自由活动精子。3级:大量的，每个凝集50个精子，仍有一些自由活动精子。4级:全部的，所有的精子凝集，数个凝集又粘连在一起。七、精子活力与活动率精子的活力即精子的运动能力。前向运动精子活力的程度与妊娠率相关。在精液液化后混匀，取一滴精液置于玻片或专门用于精液分析的计数板上，盖好盖玻片，系统地观察至少5个视野，对200个精子进行分级。按WH0（2001）标准分为"a、b、c、d"4级:a级，快速前向运动（即37℃时速度不低于25um/s,或20℃速度不低于20um/s;25um大约相当于5个头的长度或半个尾的长度）;b级，慢速或呆滞的前向运动;c级，非前向运动（5um/s);d级，不运动。精子活动率为a+b+c级精子百分率总和。鉴于技术人员很难无偏差地精确界定前向运动精子活力，使用手工分析时，WH0-5推荐使用简单的分类系统，每个精子活力按以下分级:前向运动（PR）:精子主动地呈直线或沿一大圆周运动，不管其速度如何。非前向运动（NP）:所有其他非前向运动的形式，如以小圆周泳动，尾部动力几乎不能驱使头部移动，或者只观察到尾部摆动。不动（IM）:没有运动。八、精子浓度和总数每次射精的精子总数和精子浓度与妊娠时间和妊娠率有关，并可预测受孕。精子浓度指每单位体积精液中的精子数目，精液中精子浓度与受精和妊娠率有关。国内精子手工分析常用的精子计数板有Makler、Cel-VU和MicroCel等。有研究表明，Cel-VU计数板的计数结果最低，最接近标准乳胶珠溶液浓度的参考值，而血球计数板和Makler计数板的计数结果高估。精子总数:精子浓度乘以整份精液体积可以得出精子总数。精子总数可以评价睾丸产生精子的能力和男性输精管道的通畅性。以改良牛鲍氏血细胞计数板为例加以说明:使用改良牛鲍氏血细胞计数板网格计数时，仅计数完整的精子（带有头部和尾部)。是否计数取决于精子头部的位置，可忽略精子尾部的位置。方格的边界由3条线的中间线表示。如精子头大部分位于两条内侧线中间，计数这条精子，如精子头大部分位于两条外侧线中间，则不计数这条精子。为避免在相邻的方格里计数同一个精子，精子的头部位于分隔两个相邻方格的线上，仅当此线是两条互成直角的分界线的其中一条时，才应被计数。如有很多无头精子的尾部（大头针状头)、或无尾的精子头，应在报告中记录这种情况。必要时，应以与评估精子浓度相同的方式检测它们的浓度，或者通过染色制片来确定它们与精子的相关程度。评估血细胞计数板的两个计数池内的精子数目。如果两个计数池得出的数值十分一致，可以认为取出的样本可以代表精液标本。精子总数两次重复计数可能存在的差异见表16-2。精液稀释固定液:将50gNaHC03和10ml35%（V/V）甲醛溶液加人1000ml蒸馏水中。可同时添加0.25g台盼蓝或5ml饱和（4mg/ml)龙胆紫以加深背景显示出精子头部。固定液4℃保存。表16-2对应于特定总数的两次计数之间的可接受差异（引自WH0-5)总数差异*总数差异*总数差异*35-4548-5463-7041-4755-6271-79总数差异*总数差异*总数差异*80-89197-211367-38590-98212-226386-40699-109227-242407-426110-120243-258427-448121-131259-274449-470132-143275-292471-492144-156293-309493-515157-169310-328516-538170-182329-346539-562183-196347-366563-587*:基于95%可信区间的整数近似值第三节精子存活率检测精子存活率通过检测精子膜完整性来评价，当精子活动率低于参考值时应进行精子存活率检测。通常使用染料拒染法或低渗膨胀试验来检测精子膜的完整性，从而推测精子的存活率。染料拒染法基于损伤的细胞膜、死细胞膜允许非透过膜性染料进入膜内染色。低渗膨胀试验假设只有细胞膜完整的细胞（活细胞）能够在低渗溶液中发生膨胀。一、伊红-苯胺黑染色法伊红-苯胺黑染色可提高背景与精子头间的对比度，使精子头更易鉴别。1.伊红-苯胺黑试剂配制（1）伊红Y:将0.67g伊红Y和0.9gNaCl溶解在100ml蒸馏水中，稍加热。（2）伊红-苯胺黑:将10g苯胺黑加人100ml伊红Y溶液中。将悬液煮沸，冷却至室温。用滤纸过滤溶液，除去残渣和凝胶状沉淀物，储存在深色密封瓶中。2.实验步骤取50ul精液与等体积的伊红-苯胺黑液混合，等待30s,制成涂片，空气干燥，干燥后立即检查，或非水性永久封固液封片以后再观察。用亮视野显微镜在x1000倍油镜下检查。每个重复样本评估200个精子。结果评定:用亮视野显微镜观察，活精子头部呈白色，死精子头部呈红色或暗粉红色。头部呈淡粉红色的精子认为是活精子。如果染色只限于颈部区域，头部的其余区域未染色，这种情况考虑是"颈部膜渗漏"，而不是精子死亡和整个细胞膜破裂的征象信号。这些精子应被评估为活精子。二、伊红Y染色法1.0.5%伊红Y试剂配制将5g伊红Y溶于1000ml0.9%NaCl中。2.实验步骤（1）将50ul混匀精液和50ul伊红溶液混合，取10ul上述混合液置于载玻片上。（2）覆盖22mmx22mm盖玻片，静止30s）负相差显微镜在200倍或400倍下观察)（3）计数染色精子（死精子）和非染色精子（活精子）的数目)（4）每份重复样本评估200个精子，以达到可接受的低取样误差）计算重复玻片的两个活精子百分率的平均值和差异，确定差异的可接受性）如果差异太大，重新两次精液取样制备两张新鲜玻片，再次评估)三、低渗膨胀试验作为染料拒染法的替代试验，低渗膨胀试验（H0s）可以用来评估精子的存活率）当必须避免精子染色的时候，这种方法是有用的，如卵细胞质内单精子注射（ICsI)选择精子时）膜完整的精子在低渗溶液中5min内发生膨胀，在30min内所有尾部的形状是稳定的）作为常规诊断，孵育30min,当精子处理用于治疗用途时，孵育5min)1.试剂配制（1）用于诊断目的的膨胀液.0.735g枸橡酸钠和1.351gD-果糖溶于100ml蒸馏水中）将溶液以1ml分装，冻存于-20℃)（2）用于治疗用途的膨胀液.按1份溶液加1份灭菌蒸馏水，即1:2的比例稀释溶液）2.实验步骤 （1）解冻冻存的膨胀液，使用前充分混匀) （2）取1ml膨胀液或1ml1+1（1:2）稀释溶液，置于一只加盖的微量离心管中，37℃温热5min) （3）取100ul混匀精液，加人膨胀液中）用移液管轻轻地吸进和排出，加以混匀) （4）37℃孵育5min或30min,取10ul加到洁净载玻片上，覆盖22mmx22mm盖玻片) （5）重新混匀精液标本，取重复样本与膨胀液混合）制备另一张重复玻片) （6）使用相差显微镜，在x200倍或x400倍视野下检测) （7）计数未膨胀（死的）和膨胀（活的） （8）每份重复样本评估至少200个精子，以达到可接受的低取样误差）计算重复玻片的两个活精子百分率的平均值和差异）如差异太大，重新制备两张新鲜玻片，再次评估)a.未膨胀。b.尾尖膨胀。c.尾尖弯曲膨胀。d.尾尖膨胀伴弯曲膨胀。e.尾弯曲膨胀。f.尾粗短膨胀。g.尾完全膨胀。蒸馏水作为低渗膨胀液，膨胀以“g”形为主，低渗膨胀液以“b”-“f”形为主第四节精子形态学分析精子形态学分析是评价精子受精能力的重要指标之一，人工授精或卵细胞质内单精子注射的成功率与正常形态精子百分率密切相关。目前WH0-5推荐采用巴氏、shor或Dif-0uik染色法，可以很清楚地区分精子顶体和核。Dif-0uik方法是将一滴精液加在带有固定剂和染色剂的载玻片上，因为这种涂片技术会导致精子的分布不均匀，可能无法观察到形态学分类所需细节。shor染色可以得到与巴氏染色相近的正常形态精子百分率。一、涂片的制备一般用新鲜液化精液或生理盐水洗涤过的精子悬液制备涂片，每份标本作双份涂片，以防染色或操作出问题。由于涂片之间可能存在形态学上的显著性差异，最好对两张涂片都进行形态学评估。离心洗涤等技术操作可能影响精子形态，如果使用这些方法必须记录下来。载玻片应洁净，可用70%乙醇洗涤并干燥后使用，也可用不掉屑的纸巾擦净。涂片的厚薄应根据精子浓度而定。涂片的方法有多种，WH0-5使用的方法有拉薄技术和滴管法。拉薄技术即将一滴精液沿成角度的载玻片后缘展开，载玻片向前拖拉，制成涂片;滴管法即对于已洗涤的精液持移液管水平向前推动，将一滴精子悬液沿载玻片的表面展开。精液的黏稠度越低，拉薄效果越好，拉薄技术常常不适用于高黏稠度的精液。涂片在固定及染色之前，应空气干燥至少4h，但不超过1周。二、巴氏染色法巴氏染色能使精子头部顶体区与顶体后区、过量残留胞质、尾部的中段与主段染上颜色，适用于精子的形态学分析和精液中未成熟生精细胞和非精子细胞的检查。使用巴氏染色制备的精液涂片可以长期保存。1.原理巴氏染液中的俾士麦棕为盐基性染料，伊红、亮绿和橙黄为酸性染料，能与细胞中具有相反电荷的组分相结合，而染成各种不同的颜色，从而能清晰地区别多种细胞成分。2.试剂①EA-50（表16-3)。②橙黄G6（表16-4)。③无醋酸Haris苏木精（表16-5)。④scot溶液:将NaHC033.5g和Mgs04.7H2020.0g溶于1L蒸馏水中。⑤酸性乙醇溶液:300ml99.5%乙醇中加人2.0ml浓HCl,再加人100ml蒸馏水。⑥二甲苯或Rotisol。⑦50%、70%、80%、90%、95%、99.5%乙醇。表16-3EA﹒50的成分伊红Y俾士麦棕Y亮绿sF蒸馏水95%乙醇磷钨酸饱和碳酸锂溶液10g10g10g300ml2000ml4g0.5ml表16-4橙黄G6的成分橙黄G结晶蒸馏水95%乙醇磷钨酸10g100ml1000ml0.15g表16-5Haris苏木精的成分苏木素95%乙醇AlNH4(s0)4.12H20蒸馏水氧化汞8g80ml160g1600ml6g3.操作①洁净载玻片用70%酒精洗涤后干燥，滴一小滴精液于载玻片上。②当精液黏稠度低时，用第二张载玻片的边缘在清洁载玻片表面拖拉一滴精液来制备薄片，注意涂片不宜太厚。此技术常常不适宜于精液黏稠的标本。另一种方法是滴一滴精液于一张载玻片的中央，然后将第二张盖玻片表面朝下盖在其上，使精液在两玻片间扩散，轻拉使两玻片分开即可同时制得两张片子。③涂片在空气中干燥后，用等量95%乙醇和乙醚固定5-15min。④固定好的涂片按表16-6步骤进行染色。⑤待染片干燥后，油镜观察200个精子，对精子形态进行评估。表16-6巴氏染色步骤溶液操作80%乙醇(V/V)50%乙醇(V/V)蒸馏水Haris或Mayer苏木精蒸馏水酸性乙醇冷流水冲洗50%乙醇(V/V)80%乙醇(V/V)95%乙醇(V/V)橙黄G695%乙醇(V/V)(3个缸)EA-5095%乙醇(V/V)(2个缸)100%乙醇(2个缸)30s30s30s精确4min30s浸4-8次,每次约1s5min30s30s至少15min1min每缸各浸30s1min每缸各浸30s每缸各浸15s三、精子形态学判断标准精子包括头、颈、中段、主段和末段。通过光学显微镜很难观察精子末段，形态分析主要观察精子头 （和颈）和尾（中段和主段)，只有头和尾都正常的精子才认为是正常的。所有处于临界形态的精子均归为异常。1.精子头部正常精子头外形光滑、轮廓规则，大体呈椭圆形。顶体区清晰分辨，占头部的40%-70%。顶体区没有大空泡，小空泡不超过2个，空泡大小不超过头部的20%。顶体后区不含任何空泡。头部缺陷主要包括:大头、小头、锥形头、梨形头、圆头、无定形头、有空泡的头（超过2个空泡，或者未染色的空泡区域占头部的20%以上)、顶体后区有空泡、顶体过小或过大的头（小于头部的40%，大于头部70%)、双头，或上述缺陷的任何组合。2.精子颈部和中段中段应该规则、细长，约与头部等长。中段主轴与头部长轴成一条直线。残留胞质只有在过量时才被认为是异常的，即胞质超过了精子头大小的1/3时被认为过量残留胞质。胞质小滴应小于正常头部1/3。颈部和中段的缺陷主要包括:颈部"弯曲"（颈和尾形成的角度大于头部长轴的90%)、中段非对称地接在头部、粗的或不规则的中段、锐角弯曲、异常细的中段（即无线粒体鞘)和上述缺陷的任何组合。3.精子主段主段比中段细，均一，其长约45um（约为头部长度的10倍)。尾部应没有显示鞭毛折断的锐利折角。主段可以自身卷曲成环状。主段缺陷主要包括:短尾、多尾、发卡形平滑弯曲、锐角弯曲、尾部断裂、尾部弯曲（90o)、尾部宽度不规则、卷曲，或上述缺陷的任何组合。4.过量残留胞质过量残留胞质是由于精子异常发生过程产生的。这类异常精子的特征是含有大量不规则已染色的细胞质，胞质的大小超过精子头部的1/3，常伴有中段缺陷。四、精子形态质量控制只有带有尾部的可辨认精子，才可进行精子形态分析的计数，精子头脱落或无精子头的不作计数，无尾精子亦不作为头部缺陷计数。选择精子分布不重叠的区域，在1000倍油镜下观察涂片，有顺序地对每个视野中所有可评估的精子进行分析，不可有选择地进行（图16-3)。尽管是在另一张同一标本涂片上，但也可选择同一张涂片，重复评估至少200个精子，以达到可接受的低抽样误差。根据表16-2或图16-1来确定差异的可接受性。如果差异值太大，则重复评估相同的涂片。图16-3人类精子形态异常的示意图第五节精液白细胞检测精液的白细胞主要是多形核白细胞（PMN,中性粒细胞)。有时可通过巴氏染色方法，将白细胞与精液涂片的精子细胞和精母细胞区分开来。分辨白细胞主要基于着色、核的大小及形态的不同。多形核白细胞在形态学上容易与多核精子细胞混淆，但是多核型白细胞染色呈浅蓝色，而精子细胞呈浅红色。核的大小也有助于鉴别:单核白细胞核大小的波动范围较大，从大约7um的淋巴细胞，到15um的巨噬细胞。这些大小仅作为参考，因为退化和分裂会影响核的大小。过氧化物酶阳性的粒细胞是精液中主要类型的白细胞，因此过氧化物酶活性的常规分析法有助于白细胞初筛。白细胞抗原和精子抗原的免疫细胞化学测定技术可特异鉴别白细胞。一、邻甲苯胺蓝过氧化物酶染色法（一）试剂1.67mmol/L,pH6.0的磷酸盐缓冲液将9.47g磷酸氢二钠（Na2HP04）溶于1000ml蒸馏水中，将9.08g磷酸二氢钾（KH2P04）溶于另一1000ml蒸馏水中。然后将一种溶液加人到另一种溶液中直至pH为6.0（约12ml的Na2HP04溶液加人到88ml的KH2P04溶液中)。2.饱和氯化铵（NH4Cl)容液将250gNH4Cl加人到1000ml的蒸馏水中。3.148mmol/L的乙二胺四乙酸二纳（Na2EDTA）容液将50gNa2EDTA溶人步骤1准备好的磷酸盐缓冲液（pH6.0）中。4.底物将2.5mg邻甲苯胺溶于10ml的0.9%（9g/L）氯化钠溶液中。5.30%（V/V）过氧化氢（H202）容液。6.工作液往9ml邻甲苯胺底物中加人1ml饱和NH4Cl溶液、1ml148mmol/lNa2EDTA溶液及10ul30%（V/V）H202溶液，充分混匀。该溶液配制后可使用24h。（二）步骤1.取0.1ml混匀精液并与0.9ml工作液混合。2.涡旋振荡精子悬液10s,室温放置20-30min。或使用试管摇动装置持续摇动。3.重复样本与工作液混匀。取样前，再次混匀精液标本。4.在血细胞计数板上检测过氧化物酶阳性细胞的数目。5.20-30min后，再次混匀精子悬液，并将双份重复样本分别充填计数板两侧的计数池。6.室温下将血细胞计数板水平置于湿盒内至少4min,防止干燥，使细胞沉降。7.用200或400倍镜的相差显微镜检查计数池。8.每份重复样本至少计数200个过氧化物酶阳性细胞，以达到可以接受的低取样误差。过氧化物酶阳性细胞被染成棕褐色，而过氧化物酶阴性细胞不着色。二、全白细胞CD45免疫细胞化学染色释放颗粒的多形核白细胞，以及不含过氧化物酶的其他种类白细胞如淋巴细胞、巨噬细胞或单核细胞，不能应用检测细胞过氧化物酶的邻甲苯胺实验来评估，但是可以使用免疫细胞化学方法来检测。人白细胞的所有类型表达一种特异性抗原CD45，故可用抗CD45单克隆抗体来检测不同类型的白细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞、B细胞或T细胞等。第六节计算机辅助精子分析计算机辅助精子分析（computer-aidedspermanalysis,CAsA）客观、高效、精度高，容易进行室内质控及室间质控。CAsA除可分析精子浓度和活动率等精子参数指标外，更能客观地定量评价精子运动速度和运动方式，大大克服了传统测定方法所存在的费时、信息量少、准确度差、主观性高等缺陷。与国外普遍使用人工分析不同，CAsA的使用情况在中国相对较普遍。如果标本准备和仪器使用时足够细心，CAsA在目前可用于一些临床常规诊断检测，但要建立并维持高标准的仪器操作，质量控制必不可少。CAsA分析仪能够识别活动精子，适宜应用于精子动力学分析。很多因素会影响CAsA分析仪的性能，如标本的制备、帧频率、精子浓度和计数池的深度等，因此要做好多方面的质量控制。使用前，应先对CAsA分析仪进行正确设置和调试，以保证设备良好的工作状态。制造商提供了适宜的参数，但使用者必须检查分析仪运行是否达到了其所要求的重复性和可靠性程度，必须使用适当的质量控制措施，如录像带等。因为精子的运动对温度敏感，必须将CAsA系统精液标本温度保持在37℃。在精液液化后混匀，取一滴精液置于玻片或专门用于精液分析的计数板（Makler或Macro精子计数板）上，盖好盖玻片，光学显微镜（x400)GH,系统地观察至少12个视野，每份标本至少要分析200个活动精子的运动轨迹，最好是400个。对每个标本中分析的精子数目应标准化。按WH0（2001）标准分为"a、b、c、d"4级:a级，快速前向运动（即37℃时速度不低于25um/s,或20℃速度不低于20um/s;25um大约相当于5个头的长度或半个尾的长度）;b级，慢速或呆滞的前向运动;c级，非前向运动（5um/s);d级，不运动。适宜检测精子活力的样本精子浓度为2x106-50x106/ml。当精子浓度50x106/ml时，可能会出现高频度精子碰撞，由此可能产生误差，此时应进行稀释，并且最好使用该标本的精浆稀释。精液样本稀释方法:取一定量精液样本16000g离心6min,分离上层获得无精子的精浆。用无精子的精浆稀释最初的精液标本，使精子浓度低于50x106/ml。CAsA分析可获得如下精子运动参数:①轨迹速度（curyilinearyelocity,VCL）（um/s):也称曲线速度，为精子头部沿其实际行走曲线的运动速度，即在显微镜下见到二维方式运动轨迹的时均速率，反映精子活动能力。②平均路径速度（ayeragepathyelocity,VAP）（um/s):精子头沿其空间平均轨迹的运动速度，这种平均轨迹是计算机将精子运动的实际轨迹平均后计算出来的，算法因仪器不同而有差异，故不同CAsA系统所得的数值可能不具可比性。③直线运动速度（straightlineyelocity,VsL）（um/s):也称前向运动速度，即精子头部直线移动的速度。④直线性（linearity,LIN)（%）:也称线性度，为精子运动曲线的直线分离度，即VsL/VCL。⑤精子侧摆幅度（amplitudeoflateralheaddisplacement,ALH）（um）:精子头实际运动轨迹对平均路径的侧摆幅度，可以是平均值，也可以是最大值。⑥前向性（straightness,sTR)（%）:计算公式为VsL/VAP,也即精子运动平均路径的直线分离度。⑦摆动性（wob-bly,W0B)（%）:精子头沿其实际运动轨迹的空间平均路径摆动的尺度，计算公式为VAP/VCL。⑧鞭打频率（beatcrosfrequency,BCF)（Hz):也称摆动频率，即精子头部跨越其平均路径的频率。⑨平均移动角度（ayeragemotiondegree,MAD)（度/秒）:精子头部沿其运动轨迹瞬间转折角度的时间平均值。⑩精子运动浓度:每毫升精液中VAP0um/s的精子数。第七节附属性腺生化指标的检测检测精浆中附属性腺标志性分泌物的含量，可以反映腺体功能，例如，游离左旋肉碱、甘油磷酸胆碱（GPC)、中性a-葡糖苷酶反映附睾功能;果糖和前列腺素反映精囊腺功能;柠檬酸、锌、y-谷氨酰转移酶和酸性磷酸酶反映前列腺功能等。精浆生化测定的标本可-20℃保存待测，忌反复冻融。一、精浆中性α-葡糖苷酶测定精浆中存在两种a葡糖苷酶的异构体，其中中性a-葡糖苷酶仅来源于附睾;酸性a-葡糖苷酶主要来源于前列腺，后者可以被十二烷基硫酸钠（sDs）选择性抑制，从而可以测定反映附睾功能的中性a-葡糖苷酶。用澳洲栗精胺（castanospermine）抑制药阻断非葡糖苷酶的相关底物，可使测试更敏感。精浆酸性a-葡糖苷酶被抑制，中性a-葡糖苷酶将合成的毗喃葡糖苷底物转化为对硝基苯酚，加人碳酸钠后变为黄色，其颜色深浅与单位时间内精浆中性a-葡糖苷酶活性成正比。检测精液中附睾中性a-葡糖苷酶含量有商品化试剂盒。建议使用含sDs和澳洲栗精胺的试剂盒测定精液中附睾中性a-葡糖苷酶。（一）试剂1.缓冲液缓冲液1（0.2mol/L磷酸缓冲液，pH6.8）:溶解4.56gK2HP04于100ml蒸馏水，另溶解2.72gKH2P04于100ml蒸馏水，将两者等混合至pH为6.8。缓冲液2:溶解1gsDs于100ml缓冲液1。2.显色剂显色剂1（用于终止反应，0.1mol/LNa2C03）:溶解6.20gNa2C03.H20于500ml蒸馏水。显色剂2:溶解0.1gsDs于100ml显色剂1。3.底物p-硝基苯酚叱响葡糖苷（PNPG)（5mg/ml）溶解0.1gPNPG于20ml缓冲液2，50℃加热板上搅拌，并振荡约10min。使用过程需将溶液保持在37℃。每次测试需配制新鲜试剂。4.用于精液空白的葡糖苷酶抑制药（castanospermine,10mmol/L）溶解18.9mg澳洲栗精胺于10ml蒸馏水。用蒸馏水稀释10倍为1mmol/L的工作液。约1ml分装，-20℃冻存。5.产物p-硝基苯酚（PNP）的标准曲线（5mmol/L）溶解69.5mgPNP于100ml蒸馏水，必要时加温溶液。用铝箔包裹或装在棕色玻璃瓶里，4℃避光储存。每3个月配制新鲜的标准液。6.制备标准曲线加400ul5mmol/LPNP储存液于10ml容量瓶中，加显色剂2定容至10ml（200umol/L)。将200umol/L标准液加显色剂2稀释，得到另外4个标准液:160，120，80和40umol/LPNP。）二）方法1.精液标本以2000g离心10min,精浆可保存于-20℃。2.取15ul精浆标本分别加人2个1.5ml试管中。蒸馏水空白。3.向质控样本加人8ul1mmol/Lcastanospermine,作为精浆空白值。4.每管加人37℃的100ulPNPG底物液，37℃孵育2h。5.每管加1ml显色剂1混匀。405nm波长处检测，水空白调零。6.通过比较吸光度值，从标准曲线（umol/L）上读取标本产生的PNP浓度。乘以校正因子（0.6194)，得到未稀释精浆中性葡糖苷酶的活性（U/L)。从每份标本活性减去精浆澳洲栗精胺活性，得到校正的（相关的葡糖苷酶）活性。7.精液的葡糖苷酶活性（mU）=校正的葡糖苷酶活性x精液总体积（ml)。两份重复测定结果的一致性应在10%之内。如不符，取2份新的精液标本样品，重新检测。 （三）精浆果糖测定果糖与叫味在加热和强酸的影响下形成了有颜色的复合物，对470-490nm波长有最大吸收峰，其吸光度与果糖含量成正比。可使用检测精浆果糖含量的商品化试剂盒。1.精液标本以2000g离心10min,精浆可保存于-20℃。2.取5ul精浆标本分别加人50ul蒸馏水中，混匀。3.脱蛋白:加人12.5ul63umol/LZns04和12.5ul0.1mol/LBa（0H）2，混匀。室温15min,8000g离心5min。4.取50ul上清液移人检测管。50ul每种标准液。蒸馏水空白。5.检测管加人50ul叫味液，混匀。6.检测管加人0.5ml浓盐酸（HCl,32%V/V)，用实验室模压封膜封管口，在通风橱内小心地混匀。7.50℃热水浴20min。混匀，冰水冷却15min。470nm波长处检测，蒸馏水空白调零。8.结果乘以稀释因子16精浆果糖浓度。精液中果糖的总量=果糖的浓度x精液总体积。重复样本测定结果的一致性应在10%之内。否则，新取2份重复精液标本，重新检测。 （四）精浆锌的测定精液中锌主要来自前列腺，其含量比血清中高100倍以上，精浆锌是前列腺的功能指标之一。精浆锌可用化学比色法测定。利用化合物2-（5-溴-2-毗啶）-5-（N-丙基-N-硫代丙氨基）-酚（5-溴-PAPs）[2-（5-bromo-2-pyridylazo)-5-（N-propyl-N-sulfopropylamino)-phe-nol（5-Br-PAPs)]与锌结合，生成特异性的锌-色原复合物，对560nm波长有最大吸收峰，其强度与精浆锌含量成正比。检测血清锌含量有商品化试剂盒。仅使用显色剂A和显色剂B。1.精液标本2000g离心10min,取精浆于-20℃待分析。2.取5ul精浆加人300ul蒸馏水，混匀。3.取40ul稀释精浆样本于96孔板中，每孔加200ul显色液，混匀5min。4.在560nm波长处读取结果，用水空白调零。5.通过比较吸光度值，从标准曲线上读取标本中锌的浓度。6.结果乘以稀释因子61得到精浆锌浓度。7.精液中锌的总量=锌的浓度x精液总体积。重复样本测定结果的一致性应在10%之内。即（两个估计值之差除以估值的平均值）x100≤10%。如果不符合，再次取2份重复精液样本，重新检测。第八节精子顶体完整率分析精子顶体含有顶体蛋白酶、透明质酸酶、酸性磷酸酶等多种水解酶。在受精时，精子释放顶体酶，分解卵子外周的放射冠与透明带，进入卵子内。顶体酶还能降低宫颈黏液的黏度，提高精子穿透宫颈黏液的能力。精子顶体分为4型。I型:精子形态正常，着色均匀，顶体完整，顶体边缘整齐，有时可见清晰的赤道板。Ⅱ型:顶体轻微膨胀，精子质膜疏松膨大。Ⅲ型:顶体破坏，精子质膜严重膨胀破坏，着色浅，边缘不整齐。N型:顶体全部脱落，精子核裸露。Ⅱ、Ⅲ、N型均为顶体不完整精子，计算顶体完整率时计数200个精子，计算I型顶体精子的百分比。顶体完整率（%）=顶体完整精子数/精子总数x100%精子结合卵透明带后，在卵透明带上发生生理性顶体反应。诱发顶体反应后的顶体状态检测可用荧光标记的凝集素（如豌豆凝集素、花生凝集素）或顶体抗原CD46的单克隆抗体，通过显微镜或流式细胞仪分析结果。顶体状态荧光检测方法如下。一、试剂1.PsA-FITC豌豆凝集素（PsA)，用异硫氰酸荧光素（FITC）标记。2.磷酸盐缓冲液（PBs)，pH为7.4。3.0.9%（9g/L）的氯化钠溶液。4.95%（V/V）的乙醇溶液。5.PsA储存液将2mg用FITC标记的PsA溶解于4mlPBs中，-20℃保存。PsA工作液:将0.5mlPsA储存液稀释于10mlPBs中，储存于4℃备用（可存放4周)。二、精子洗涤1.将0.2ml混匀精液加人10ml生理盐水中。2.800g离心10min。弃去上清液，留下20-40ul上清液。轻柔吹打，将精子沉淀团重悬于留下的上清液中。3.重复以上精子洗涤操作步骤。4.用生理盐水将上游后或经过一次密度梯度离心的精子悬液稀释至10ml。5.重复步骤2。6.取5ul精子悬液，制成约1cm长的精子涂片，共做2张重复涂片。7.在400倍相差显微镜下观察湿涂片。确保精子均匀分布在玻片上，不聚集。8.空气中干燥玻片。9.95%（V/V）乙醇固定30min。10.空气中干燥玻片。11.加10mlPsA-FITC工作液到垂直染色缸中。12.将已固定并空气干燥的涂片浸在PsA-FITC荧光染料中。13.在4℃条件下，染色1h以上。14.用纯净水洗涤每张玻片，并且用可溶于乙醇的封片剂封片。15.结果评估:用450-490nm激发光，于400倍油镜下观察精子涂片。精子分类如下。顶体完整（acrosome-intact,AI):精子头部一半以上荧光染色明亮且均匀。已发生顶体反应（acro-some-reacted,AR）:精子仅在赤道带出现荧光带，或者顶体区根本没有荧光染色。顶体异常:除上述两类精子外的所有其他精子。每张涂片计数200个精子，以达到可接受的低取样误差。计算2张重复涂片已发生顶体反应精子百分率的平均值和差异。如果差异太大，则重新评估。.第九节抗精子抗体的检测精液中的抗精子抗体大多为IgA和IgG,IgM抗体相对分子质量较大在精液中极少发现。IgA抗体可能比IgG抗体具有更重要的临床意义。精子表面抗体检测可采用直接免疫珠（IB）试验和混合抗体蛋白反应（MAR）试验。检测精浆、血清、宫颈黏液中抗精子抗体的间接试验可采用间接免疫珠（IB）试验和酶联免疫吸附法（ELIsA）试验。直接免疫珠和混合抗体蛋白反应试验采用新鲜精液标本，而间接免疫珠试验采用洗涤过的精子。这两种试验的结果并不总是一致，但间接免疫珠试验的结果与检测血清抗体的制动试验的结果相关性很好。一、