《柑橘衰退病毒基因型鉴定技术规程》

1柑橘衰退病毒基因型鉴定技术规程本文件规定了实验室鉴定柑橘衰退病毒基因型本文件适用于柑橘类植物感染柑橘衰退病毒的RT-本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，3.2反转录·聚合酶链反应ReverseTranscription-polymeraseChainReaction,RT-PCR4柑橘衰退病毒基因型信息根据柑橘衰退病毒外壳蛋白基因（Coatproteingene,CPG）内的保守区域设计特异性引物CPG-F/CPG-R，通过RT-PCR检测样品是否携带柑橘衰退病毒。然后利用柑橘衰退病2柑橘衰退病的田间症状具有一定的复杂性，根据指示植物表现的表型可分为3种症状SP）。其中苗黄型会引起幼苗的黄化，速衰型引起根系死亡，造成整个植株的快速死亡，田间以茎陷点型症状发生较为普遍，主要引起甜采集的样品分别用样品袋进行分装，放入适量样品的记录，将样品记录和样品3d内一并寄送实验室进行检测。对接收样品进行登记编3每份样品选取5片叶片。使用一次性刀片，切取叶片中部主脉及侧脉部分，每份样品），积异丙醇，并轻柔混匀，置于-20℃表1柑橘衰退病毒cDNA合成体系试剂（Reagent）每管用量（(Volume，µL）①10μmol/L随机引物（6N）12.5mMdNTPs1模板RNA3②5×RTBuffer4RNA酶抑制剂（40U/µL）0.5反转录酶（5U/µL）1DEPCH2O4.5合计47.5.3反转录反应程序：在PCR管中加入5µL的反转录混表2柑橘衰退病毒PCR扩增体系试剂（Reagent）每管用量（(Volume，µL）10×PCRBuffer4.510μmol/L上游引物（F）0.510μmol/L下游引物（R）0.52.5mMdNTPs2r-TaqDNA聚合酶0.4cDNA1DEPCH2O合计257.5.5样本柑橘衰退病毒PCR检测的特待检样品核酸经RT-PCR扩增后，产物经电泳于凝胶成像系统观察，凝胶上阳性对照出现一条大小为771bp的特异性条带，阴性对照没有任何扩增条带，表示检测过程正常，5方可进入下一步骤。待检样品若出现与阳性对照相同大小的771bp特异性条带，则判定该样品为阳性，即携带柑橘衰退病毒，若未出现771bp特异性条带，则判定样品为阴性，即（T36）、491bp（T68）特异性条带，阴性对照没有任何扩增条带，表示检测过程正常，方可进入下一步骤。待检样品若出现与阳性对照相6（资料性）A.1柑橘衰退病症状注：B图来自MorenoP,AmbrósS,Albiach-MartíMR,GuerriJ,PeñaL.Citrustristezavirus:apathogenthatchangedthecourseofthecitrusindustry.MolPlantPathol.2008,9(2):251-268.7B.1柑橘衰退病毒基因型鉴定引物表3柑橘衰退病毒基因型鉴定引物信息VTF:GGAGTCGGACGGGCGGTR:ATARCAGTAACCGTCCTTCF:CTATTGATGTTGGTTATRACGTR:ACTGCGTTCGCTAGTGACAR:ACTGCGACGGAATGCTCTAR:TCTTGGGGACTTTCACGCF:ACAACGGT