抱子甘蓝组织培养快繁技术规程

1抱子甘蓝组织培养快繁技术规程本标准规定了抱子甘蓝组织培养快速繁殖过程中的术语和定义、培养基制备、组培室消毒灭菌、抱子组培苗生产等方面的技术规程。本标准适用于抱子组织培养繁殖苗木。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。DB15/T1939—2020文冠果组织培养育苗技术规程NY/T391绿色食品产地环境质量3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1外植体explant植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段。外植体通常选择生长健壮的无病虫的植株上的正常器官或组织。3.2接种inoculation在无菌条件下将表面灭菌后的外植体或继代、生根组培材料接入培养基的过程。4培养基配制4.1培养基配方MS培养基：具体成分见附录A中的表A.1。改良MS培养基，配方为：用Ca（NO3）2•4H2O代替原MS培养基中的CaCl2•2H2O并添加核黄素，其他组分均无变化；在改良MS培养基中Ca（NO3）2•4H2O的浓度为60mg/L，核黄素的浓度为5mg/L。MS制备用于不定芽诱导的培养基，配方为：在所述改良MS培养基上添加6-苄氨基嘌呤（6-BA）、6-糠基氨基嘌呤（KT）以及吲哚乙酸（IAA在不定芽诱导培养基中6-苄氨基嘌呤（6-BA）的浓度2IAA）的浓度为0.为0.8mg/L，6-糠基氨基嘌呤（KT）的浓度为0.6mg/L，吲哚乙酸（2mg/L。制备用于继代增殖的培养基，配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加6-苄氨基嘌呤（6-BA）、6-糠基氨基嘌呤（KT）以及吲哚乙酸（IAA），在继代增殖培养基中6-苄氨基嘌呤（6-BA）的浓度为1mg/L，6-糠基氨基嘌呤（KT）的浓度为0.5mg/L，吲哚乙酸（IAA）的浓度为0.2mg/L。制备用于无菌生根的培养基，配方为：在所述改良MS培养基的基础上添加吲哚丁酸（IBA）和吲哚乙酸（IAA），在生根培养基中吲哚丁酸（IBA）的浓度为0.1mg/L，吲哚乙酸（IAA）的浓度为5mg/L。4.1培养基母液及培养基配制按照DB15/T1939—2020执行。4.2环境与器具消毒灭菌按照DB15/T1939—2020执行。5组织培养技术5.1外植体及其消毒选取生长健康的抱子甘蓝幼嫩的枝条作为外植体；用中性洗涤剂洗涤洗枝条，以去除枝条表面的污垢，然后去除多余的叶片，干净纸巾吸干表面水分。在超净工作台上，先用70%酒精浸泡10-30s，再用无菌水冲洗3次，每次3-5min。立即转入0.1-0.3%的升汞溶液中消毒5-8min，最后用无菌水洗涤3-5次，每次3-5min，得到消毒外植体。5.2不定芽诱导在超净工作台内，将消毒外植体切割成0.4-0.5cm长的单芽或双芽茎段，然后将茎段接种于用于不定芽诱导的培养基；每瓶接1～3个外植体，分布均匀，封好瓶口后，注明品种代号、接种人员及日期等，放至培养室培养，诱导培养18-22d，得到抱子甘蓝不定芽。诱导培养条件如下：温度为26±3℃,湿度为80-90%，光照时间为14h/d，光照强度为800-12001x。5.3继代增殖将不定芽诱导产生的丛生芽苗，去除基部愈伤组织及生长不良的组织，切分成2～4株一簇的小芽丛，接入继代培养基，置于培养室培养，继代培养20-25d，得到抱子甘蓝无菌苗。接种数量根据培养容器的大小决定，要求材料摆布均匀，间距1.0cm～2.0cm。继代增殖培养条件如下：温度为26±3℃,湿度为50-65%，光照时间为14h/d，光照强度为800-12001x。35.4无菌生根当继代增殖培养的抱子甘蓝无菌苗生长到2.0cm-5.0cm时，进行切繁，并保持每株均有一个不定芽，接入用于无菌生根的培养基中进行生根培养15-20d，得到抱子甘蓝幼苗。接种数量根据培养容器的大小决定，要求材料摆布均匀，间距1.0cm-2.0cm。无菌苗在培养基中的插入深度为5mm-8mm，保持壮苗直立。生根培养条件如下：培养温度为26±3℃,湿度为50-65%，光照时间为14小时/天，光照强度为800-12001x。5.5炼苗当组培瓶苗达到根长0.5cm、苗高3cm后时，将其置于温度为26±3℃,湿度为50-65%，光照时间为14h/d，光照强度为800-12001x的温室苗床上，锻炼3d后，去掉封口膜，再置于温室内小拱棚中，继续锻炼4d。5.6移栽基质处理：采用体积比为草炭：蛭石：废菇料为1:1:1混合物为基质。基质混合过程中均匀喷入多菌灵800倍液。移栽：用镊子取出组培瓶苗，在流动水下洗去残留培养基，避免损伤苗根；在口径9cm、深12cm的营养钵内填装适量基质，将清洗后的组培瓶苗移栽到营养钵中，过程中避免伤根。移栽后置于小拱棚内。保持棚内温度25-30℃,浇水遵循见干见湿原则。5.6定植基地环境质量应符合NY/T391的规定。选择土层厚、土壤肥沃、富含有机质、排灌方便的壤土。定植前2-3天，土壤含水量60%左右时，667m2选用50%乙草胺乳油100-150mL对水500kg，喷雾除草。每667m2施优质有机肥4000-5000kg、过磷酸钙50kg、硫酸钾20kg作基肥，耕深25-30cm并整平。定植行距70cm，株距45cm，浇定根水1-2次。4（资料性附录）表A.1MS培养基混合母液配制表母液名称编号化试名称mg/L扩大倍数扩大后称mg母液定容体积mL配置培养基吸取量mL/L大量元素ANH4NO3406600025KNO34076000MgSO4·7H2O3704014800BCaCl2·2H2O44044000CKH2PO417000铁盐DFeSO4·7H2O27.82780Na2EDTA·2H2O37.23720微量元素EMnSO4·4H2O22.32230ZnSO4·7H2O8.6860H3BO36.2620有机成分FKI0.83Na2MoO4·2H2O0.2525CuSO4·5H2O0.0252.5CoCl2·6H2O0.0252.5G甘氨酸22001盐酸硫胺素B10.1盐酸吡哆酸B60.550烟酸0.550H肌醇50005005（资料性附录）抱子甘蓝中文名：抱子甘蓝拉丁学名：BrassicaoleraceaL.var.gemmiferaZenker别称：小圆白菜、小卷心菜、芽卷心菜、芽甘蓝分类：十字花科芸薹属甘蓝种植株特征：二年生草本，被粉霜。茎粗壮，直立，高0.5-1米，茎的全部叶腋有大的柔软叶芽，直径2-3厘米。二年生茎有分枝，具茎生叶。基生叶及下部茎生叶长圆状倒卵形至圆形，长和宽达30厘米。顶端圆形，基部骤窄成极短有宽翅的叶柄，边缘有波状不显明锯齿;上部茎生叶卵形或长圆状卵形，长8-13.5厘米，宽3.5-7厘米，基部抱茎;最上部叶长圆形，长约4.5厘米，宽约1厘米，抱茎。总状花序顶生及腋生;花淡黄色，直径2-2.5厘米;花梗长7-15毫米;萼片直立，线状长圆形，长5-7毫米；花瓣宽椭圆状倒卵形或近圆形，长13-15毫米，脉纹显明，顶端微缺，基部骤变窄成爪，爪长5-7毫米。长角果圆柱形，长6-9厘米，宽4-5毫米，两侧稍压扁，中脉突出，喙圆锥形，长6-10毫米;果梗粗，直立开展，长2.5-3.5厘米。种子球形，直径1.5-2毫米，棕色。花期4月，果期5月。生存环境：（1）温度。抱子甘蓝喜冷凉的气候,耐寒力很强，在气温下降至-4--3℃时也不致受冻害,能短时耐―13℃或更低的温度。抱子甘蓝耐热性较结球甘蓝弱,其生长适温为18-22℃。小叶球形成期最适温度为白天15-22℃,夜晚9-10℃,以昼夜温差10-15℃的季节或地区生长最好。（2）光照。抱子甘蓝属长日照植物,但对光照要求不甚严格。光照充足时植株生长旺盛,小芽球坚实而大。在芽球形成期如遇高温和强光，则不利于芽球的形成。（3）水分。整个生长期