2023结核病实验室诊断技术研发进展

2023结核病实验室诊断技术研发进展(完整版)

摘要

结核病的精准防控需要快速、准确的实验室诊断技术。自1882年罗伯特・科

赫发现结核分枝杆菌以来，结核病诊断技术经历了从传统的病原学诊断到

免疫学和分子生物学诊断的巨大飞跃，然而这种诊断技术的发展仍然与实

现2035年终止结核病的宏伟目标存在一定差距。作者在梳理既往结核病

诊断技术研发进展的基础上，围绕结核病防控的核心诊断需求，探究未来

实验室诊断的重要发展管线。

关键词：分枝杆菌，结核；分子诊断技术；感染；诊断

结核病是全球公共卫生面临的重大挑战之一。世界卫生组织(World

HealthOrgnization,WHO)《2022年全球结核病报告》指出，2021年

全球有新发结核病患者1060万例，其中分别有超过90%和63%的患者

来自于30个结核病高负担国家和“一带一路"国家。我国作为耐多药结核病

(multidrug-resistanttuberculosis,MDR-TB)及利福平耐药结核病

(rifampicin-resistanttuberculosis,RR-TB)高负担国家,2021年结核

病发病约78万例，其中MDR/RR-TB患者约3.3万例，在30个结核病

高负担国家中列第3位，仅次于印度和印度尼西亚，占全球发病患者数的

我国的结核病防控形势依然严峻，实现"终止结核病策略"任重道远。

7.4%0

结核病防治面临诸多挑战，其中，结核病实验室诊断不足严重制约了患者

的发现，造成患者的诊治延误和结核病的人际间传播。WHO统计数据显

示，我国仅有58%的肺结核患者具有细菌学实验室证据，低于全球平均水

平，其余肺结核患者的诊断依靠临床表现及影像学证据，缺乏特异性。仅

依靠医生的经验开展诊断易造成误诊、过诊和漏诊，迫切需要快速、准确、

价廉的诊断技术为结核病患者诊断提供实验室证据。结核病实验室诊断基

于不同样本类型，使用病原学、分子生物学、免疫学等多种方法发现患者

标本中结核分枝杆菌及其耐药性证据，为临床医生提供结核病诊断和治疗

依据。痰涂片和培养是目前应用最广泛的结核病实验室诊断技术，但较低

的敏感度极大地限制了对结核病患者的阳性检出率。近年来，随着分子生

物学技术的突飞猛进，涌现出一批用于结核病早期诊断的快速诊断技术,

例如GeneXpertMTB/RIF、DNA测序等，分子生物学检测技术极大地补

充了传统细菌学诊断方法。WHO报道，从2000年到2019年全球结核

病的致死率降低了41%,尽管如此，仍然有300万例患者被漏诊，这说

明当前结核病实验室诊断远无法满足临床需求。

在结核病高负担国家中，不同结核病患者数量分布导致结核病疫情负担呈

现不同特点。因此，各国对结核病实验室诊断技术的主要需求也各不相同。

在中低收入国家中分为3大类：第1类为结核病高负担国家，如印度、印

度尼西亚、中国等8个国家的结核病负担合计占全球的2/3以上，以结核

病患者数多、结核分枝杆菌潜伏感染人群数量巨大为特点，亟需用于结核

病患者筛杳发现的诊断技术满足其临床需求；第2类为耐药结核病高负担

国家，如俄罗斯联邦、孟加拉国、安哥拉等，亟需补充完善耐药结核病诊

断和用于疗效评价的诊断技术；第3类为TB/HIV双重感染高负担国家,

如博茨瓦纳、喀麦隆、几内亚等，以TB/HIV双重感染患者居多，HIV感

染造成的免疫缺陷继发结核感染比例较高，因此，这类国家亟需解决

TB/HIV双重感染者中结核病患者的诊断及潜伏感染的诊断难题。与上述

国家的基本情况有所不同，虽然作为结核病的高负担国家，我国的结核病

发病率低于全球平均水平，但是在发现患者中处于疾病早期阶段的患者比

例较高，亟需用于临床诊断结核病患者的适宜检测工具，以实现菌阴肺结

核的早发现、早诊断、早治疗，从而极大地改善患者预后，减轻社会经济

负担，实现终止结核病。

一、结核病实验室诊断技术发展的历史沿革

(-)国际结核病诊断技术的历史沿革

1.结核病细菌学诊断领域历史沿革：1882年罗伯特•科赫发现结核分枝杆

菌后，痰涂片镜检技术以操作简单、成本低等优点，成为沿用至今的重要

的结核病筛杳工具。但是基于萋-尼(Ziehl-Neelsen,Z-N)抗酸杆菌染色

的普通光学显微镜检查需要每毫升痰标本中结核分枝杆菌浓度达到10

000条菌以上方能检出，耗时耗力，且敏感度较低；随着荧光染色技术的

发展，基于金胺O荧光染色的传统荧光显微镜(FM)和发光二极管荧光显

微镜(LED-FM)检查逐渐应用于临床结核病患者的发现和随访疗效监测，

荧光显微镜的使用提高了检测敏感度并极大缩短了检查时间。在分枝杆菌

培养方面，20世纪30年代Lowenstein和Jensen研制了含孔雀绿的用

于体外培养分枝杆菌的固体培养基。该方法一直沿用至今。1969年

DeLand和Wagner开发微生物半自动培养系统用于结核分枝杆菌复合

群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex,MTBC)液体分离培养及药物

敏感性试验。分枝杆菌培养逐渐发展为诊断结核病的"金标准"，其检测下

限可达100条/ml活的结核分枝杆菌。

2.结核病分子生物学诊断领域历史沿革：分子生物学技术的应用是结核病

诊断的革命性进展。近20年来国际结核病实验室诊断技术进展主要是围

绕着分子技术领域开展传统的基因扩增技术在20世纪90年代有所应用，

但是因为污染造成的假阳性结果限制了其在临床的大范围推广。2003年

环介导等温扩增技术(tuberculosis-loop-mediatedisothermal

amplification,TB-LAMP)开创了半自动结核病分子生物学检测的先河，

并于2016年获得WHO推荐用于结核病的筛杳。2008年WHO推荐分

子生物学检测平台线性探针技术用于MTBC菌种鉴定及利福平和异烟的

耐药性检测。但是上述平台需要手动操作并存在潜在的污染风险，限制了

其在基层实验室的使用。2010年全自动Xpert®MTB/RIF平台上市用于

MTBC和利福平耐药性检测，该系统是目前全球使用范围最广的结核病实

验室诊断设备；2016年Xpert®MTB/RIF平台进行技术优化，敏感度进

一步提升，研发出Xpert®MTB/RIFUltra平台用于MTBC和利福平耐药

性检测，并于2017年获得WHO推荐。2020年WHO正式推荐印度

TruenatTMMTB-RIF-Dx用于结核病及利福平耐药的快速诊断。综上，

全球结核病实验室诊断的发展朝向自动化和高敏感度的方向不断前行。

3.结核病抗原抗体诊断领域历史沿革：2011年WHO对全球市场上多个

结核病血清学诊断试剂盒应用情况进行Meta分析，结果显示在肺结核患

者中结核病血清学诊断试剂盒总体敏感度为0700%,特异度为

31.0%~100%，差异明显。因此,WHO限制其在结核病患者筛查中使用，

特别是在结核病高流行国家。尽管WHO对于抗体诊断持否定态度，但基

于尿液的抗原检测技术却成为结核病实验室诊断的潜在的重要方向。2011

年基于尿液中MTBC脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan,LAM)抗

原标志物研发的AlereDetermineTMTBLAMAg试剂盒，通过在非洲

多个国家的系统性评估，于2015年WHO推荐其用于TB/HIV双重感染

者的结核病检查。抗原检测为结核病实验室即时检验(point-of-care

testing,POCT)技术开辟了新方向。

4.结核分枝杆菌感染检测领域历史沿革2020年全球结核分枝杆菌潜伏感

染者占总人数的1/4,且其中5%~10%可能发展为活动性结核病患者。

1934年，FlorenceSeibert从旧结核菌素中提取了单一的蛋白沉淀物，

并将其命名为纯蛋白衍生物(purifiedproteinderivative,PPD),PPD

经皮内注射后可引发迟发型变态反应(delayedtypehypersensitivity,

DTH),后续用于检测机体是否接触过结核抗原。PPD为多种蛋白的混合

物，之后早期分泌抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)陆续被证

实作为结核分枝杆菌感染后的主要特异性递呈抗原，可以激活记忆性淋巴

细胞释放Y-干扰素，据此开发了多种感染检测试剂盒，以

QuantiFERON®-TBGoldInTube(QFT-GIT)和QuantiFERON®-TB

GoldPlus(QFT-Plus)为代表。2018年WHO正式推荐QFT©-GIT和

T-SPOT®.TB试剂盒用于结核分枝杆菌潜伏感染筛杳，这对使用免疫抑制

剂前、老人或儿童等特殊人群的诊断意义重大。此外，2022年WHO推

荐了包括印度血清研究所的Cy-Tb和俄罗斯Generium的Diaskintest®

在内的基于结核特异性抗原的结核抗原皮肤试验(tuberculosis

antigen-basedskintests,TBST)用于结核感染的检测。

5.耐药结核病诊断领域历史沿革：传统耐药检测是以观察结核分枝杆菌在

含药培养基中的生长受抑制情况来区分敏感菌和耐药菌。传统表型方法以

比例法、耐药比例法、绝对浓度法为代表，但这些方法耗时费力、操作复

杂。BACTEC放射性方法和分枝杆菌生长指示管法(mycobacteriagrowth

indicatortube,MGIT)等自动化方法进行药物敏感性检测，可以更加快

速地检测药物的耐药性。2002年，美国食品药品监督管理局批准BACTEC

MGIT960用于结核分枝杆菌对链霉素、异烟阴、利福平、乙胺丁醇和口比

嗪酰胺的药物敏感性试验。BACTECMGIT960在阳性检出率和培养时间

上具有明显的优势，缩短了报告时间，但是仍会延误结核病的治疗。近年

来，根据耐药结核病的产生机制，涌现出一批基于耐药遗传性状的基因型

检测方法。WHO推荐GeneXpertMTB/RIF或GeneXpertMTB/RIF

Ultra作为结核病和利福平耐药的初始诊断检测方法，同时推荐了中等复

杂程度自动化核酸扩增试验(moderatecomplexityautomatedNAAT)

用于诊断结核病，以及检测利福平、异烟月井和其他二线抗结核药物的耐药

性，特别是用于HIV阳性者。2021年，WHO共批准6项用于结核病诊

断和抗结核药物耐药性检测的分子诊断技术，按照复杂程度分别为：低复

杂程度自动化检测平台Xpert®MTB/XDR;中等复杂程度自动化检测平

台RealTimeMTB和RealTimeMTBRIF/INH、MAXTMMDR-TB、

cobas@MTB和cobas®MTB-RIF/INH、FluroType@MTB和

FluroType@MTBDR高复杂磔检测平台GenoscholarTMPZA-TB口。

目前，快速分子诊断技术的使用仍然不足，加速推广尤为重要。

(~)国内结核病诊断技术的历史沿革

依托于"十一五""十二五"和"十三五"传染病重大专项的支持，我国在结核

病实验室诊断领域的研发和推广方面取得了积极的进展。结核病定点医院

作为结核病诊疗的主要医疗机构而布局多种结核病的筛查技术，包括抗酸

杆菌染色涂片、分枝杆菌培养、表型药物敏感检测、分子生物学、免疫学

等一系列鉴别诊断和耐药检测工具，而非定点医院在通过痰涂片或分子生

物学技术发现活动性结核病患者后，根据患者治疗需要将患者转诊至结核

病定点医院。因此，非定点医院对高敏感度、快速筛查结核病等方面具有

巨大的需求，以期发现更多的初筛结核病患者。近年来，在分子诊断领域，

我国开发了多项具有独立知识产权的新诊断平台。

1.结核病鉴别诊断及耐药检测领域：⑴基于RNA的等温扩增技术：依托

拥有独立自主知识产权的RNA恒温扩增实时检测技术(simultaneous

amplificationandtesting,SAT)(2010年获得专利审批)的体外定性检测

MTBC核酸试剂盒于2011年获得批准上市，因该试剂盒靶标为MTBC核

糖体RNA(rRNA),不仅可用于肺结核的诊断，还可以用于抗结核治疗效

果监测、肺外结核诊断等。Yan等前瞻性地对纳入的3608例疑似肺结核

患者的痰标本使用SAT法进行检测，其中，2457例以通过微生物培养鉴

定、肺部结核病灶病理学或临床诊断为活动性^结核后经抗结核治疗效果

良好等明确诊断为肺结核，SAT检测的敏感度、特异度和准确率分别为

75.8%,100.0%和80.2%0SAT敏感度明显高于痰涂片(23.8%)(x

2=1327.437,P=0.000)，但明显低于痰培养(89.0%)(x2=148.197,

P=0.000);特异度明显高于痰涂片(96.3%)(x2=20.375,P=0.000),但

与痰培养(99.6%)相比差异无统计学意义(x2=2.004,P=0.500)o痰标

本进行SAT检测的阳性结果表明活动性肺结核患者排出痰液中携带活的

分枝杆菌且抗结核治疗时无论涂片和培养检杳结果如何均推荐使用SAT

进行检测。(2)基于DNA的等温扩增技术：交叉引物等温扩增(cross

primingamplification,CPA)于2008年获得中国发明专利后，该目标产

品的试剂盒在国内开展了多项应用研究。Zhang等于2019—2020年间

连续收集249例可疑肺结核患者的样本，其中已确诊的169例肺结核患

者中，CPA和Xpert®MTB/RIF技术均能检出培养阳性的患者样本，但

对于涂阴和培阴的结核病患者样本检测，CPA阳性检出率明显高于

Xpert®MTB/RIF方法[44.59%(33〃4)和22.97%(17/74)殍=7.732,

P<0.01];对于特殊人群，北京儿童医院在2021年对239例儿童患者胃

液样本同时用CPA和Xpert®MTB/RIF检测，两种检测方法在总的活动

性结核病患者中显示敏感度相似[22.6%(31/137)和26.3%(36/137)],在

细菌学确诊结核病患者中敏感度均为60.0%(9/15),特异度分别为

98。％(100/102)和99.0%(101/102).(3)多色熔解曲线分析技术

(multicolormeltingcurveanalysis,MMCA®):MMCA®是国产的具

有完全自主知识产权的检测技术，是涵盖菌种鉴定、分子药物敏感性试验、

个体化用药指导、菌种溯源等全方位检测的产品矩阵，在结核分枝杆菌耐

药突变检测方面目前已有5项产品获国家三类医疗器械注册证，其中，对

利福平和异烟月井耐药检测产品于2013年1月份获批，对氟喋诺酮类、乙

胺丁醇、链霉素耐药检测产品于2016年9月份获批，耐药检测产品经解

放军总医院第八医学中心、河南省疾病预防控制中心和深圳市慢性病防治

中心进行临床验证，总符合率均为93%以上。(4)基因芯片耐药结核病检

测技术：基因芯片菌种鉴定及耐药结核病检测试剂及系统是国内拥有独立

自主知识产权的产品，结核分枝杆菌菌种鉴定技术于2008年获得批准，

耐药检测技术专利于2011年获得审批，菌种鉴定及耐药检测试剂盒均于

2010年获得批准上市。2019年对我国主流的结核分枝杆菌分子生物学耐

药性检测技术应用进行Meta分析，共纳入分析159项研究，结果显示基

因芯片检测利福平和异烟阴耐药性的敏感度分别为89%和79%0目前该

产品在全国约148家医疗机构使用，用于MTBC菌种鉴定及异烟朋和利

福平耐药性检测。

2.结核分枝杆菌潜伏感染检测领域：国内推出了多种基于酶联免疫吸附测

定(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)方法或者酶联免疫斑

点法(enzyme-linkedimmunospotassay,ELISPOT)为基础的以检测结

核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6和CFP-10刺激人体结核分枝杆菌致敏T

淋巴细胞释放的Y-干扰素辅助诊断结核病。ELISA方法可检测人血清或全

血中Y-干扰素水平；ELISPOT法产品主要检测人血液中结核分枝杆菌致敏

T淋巴细胞数量。其中TB-interferon-gammareleaseassay(TB-IGRA)

技术于2022年被WHO推荐用于结核分枝杆菌感染辅助诊断，与

QFT®-GIT、T-SPOT®.TB诊断效能相当。此外，白细胞介素

2(interlukin-2,IL-2)和人10kD丫-干扰素诱导蛋白

(interferon-inducibleprotein-10,IP-10)作为新型的诊断标志物，可提

高对结核分枝杆菌感染患者的检出率。作为传统PPD的同类体外诊断技

术，结核菌素皮肤试验(C-tuberculinskintest,C-TST)是基于结核分枝

杆菌特异性抗原作为刺激物，因此具有更高的特异度，已进入2022年

WHO的潜在推荐目录。

二、结核病领域实验室诊断研发前沿进展

日益丰富的分子生物学技术变革了结核病实验室诊断，大幅缩短了结核病

的诊断周期。近年来，围绕载菌量较低的活动性结核病患者，开展了多项

新技术的研发与应用，旨在实现对传统病原学阴性的结核病患者提供实验

室证据。目前的研究主要围绕如下问题开展：第一，寻找非痰标本标志物，

当前患者就诊时常因无痰或者无法采集高质量痰液，导致无法提供准确、

快速的实验室诊断依据，如尿液、血液、呼气检测标志物等，这类技术的

开发也为居家结核病早期筛查提供了重要的技术储备；第二，菌阴结核病

的患者不能被忽视，尤其其他证据支持诊断结果为结核病，但后续治疗时

因无法获取纯培养物，抗结核治疗方案会被延迟制定，需寻找更加敏感及

耐药性检测工具或者其他新型检测工具；第三，结核分枝杆菌潜伏感染人

群巨大，基于新型诊断标志物实现潜伏感染和活动性结核病的鉴别诊断将

对结核病的精准防控至关重要。

1.结核分枝杆菌新型分子生物学诊断方法：全基因组测序技术（whole

genomesequencing,WGS）可获得详细的细菌全基因序列，分析耐药基

因突变从而预测其耐药表型。一项涵盖北美和欧洲等8个实验室的多中心

研究显示使用WGS进行结核分枝杆菌鉴定和耐药检测的准确率达93%0

针对5个结核病高流行地区的900份临床标本的比较分析发现，WGS对

异烟的（敏感度98.8%;特异度96.6%）,左氧氟沙星（敏感度94.8%;特异

度97.1%）,卡那霉素（敏感度93.1%;特异度98.3%）、阿米卡星（敏感度

97.2%特异度98.6%）和卷曲霉素等耐药预测的准确度较高，但对利福平、

毗嗪酰胺和乙胺丁醇的耐药性预测的特异度欠佳。与表型药物敏感性试验

相比，WGS可提前21d生成报告，预计每年可节省7%成本。同时，将

表型药物敏感性试验和WGS结果联合分析，可以产生精准的耐药性分析,

这有利于个体化医疗中药物及剂量选择。因此，WGS已成为一种有效的

菌种鉴定和预测药物敏感性的工具。此外，WGS还可以识别细菌对新药

的耐药突变位点。但是由于测序设备较为昂贵，需要专业人员进行生物信

息分析，目前未能在临床尤其是基础设施较差地区大范围推广。

2.结核分枝杆菌抗原诊断方法：尿液中LAM的抗原检测成为一种重要的

结核病实验室检测发展方向。2015年WHO推荐尿液LAM抗原检测技术

用于活动性结核病合并HIV感染者中检测结核病的方法。2020年相继有

3项针对儿童结核病、HIV阴性成人结核病及HIV阳的市外结核患者进行

FujiLAM诊断效能评估，突显LAM作为结核病快速筛杳的生物标志物的

潜力，但在HIV阴性成人结核病筛查方面依然缺乏前瞻性队列研究数据。

NanoDisk-MS是将抗体标记的纳米颗粒与高通量质谱结合,检测血液中

结核分枝杆菌CFP-10和ESAT-6多肽,具有95.8%的特异度，在菌阴肺

结核患者中有85.3%的敏感度，菌阳肺结核患者中有91.6%的敏感度。

NanoDisk-MS有望作为一种准确、快速的生物标志物检测方法。此外，

多项研究检测血液、尿液、痰液或培养液中的结核分枝杆菌抗原CFP-10.

Ag85、HspX、MPT64等用于结核病诊断，但样本量较少，有必要进一

步开展研究用于评估其在结核病快速诊断中的应用。

3.基于组学的结核病诊断方法：2020年Noursadeghi团队就初治结核病

和结核病高负担环境下活动性肺结核患者的血液转录组特征进行系统性

分析，分别评估了不同标志物在初治结核病诊断方面的效能，从27组转

录标志物中筛选出1组单一转录本(BATF2)和7组由干扰素信号调节的多

个转录本组成的血液转录标志物，未来将在各类人群中进行诊断效能评估

获得最优的结核病筛查转录标志物组合。Xpert®TBHostResponse试

剂盒及检测平台通过检测患者血液中3个结核分枝杆菌感染相关基因

(GBP5,DUSP3及KLF2)mRNA表达情况，通过特殊算法计算分值，超

过阈值被认为感染结核分枝杆菌，低于该阈值则认为未感染，该检测平台

借助Xpert®MTB/RIF高度自动化平台，且检测样本为血液，已有多篇

文献报道该检测平台作为第一款结核病POCT产品意义重大，且与

Xpert®MTB/RIF及培养进行比较，诊断效能无差异，达到了WHO目标

产品目录对诊断产品性能的要求(对结核病确诊患者诊断敏感度＞90%,特

异度＞70%)。

4.基于结核病患者免疫标志物的诊断方法：活动性结核病患者自身免疫系

统与结核分枝杆菌互作情况不同患者血液中宿主血清蛋白-细胞因子产生

水平不一。基于此，Ahmad等借助超敏细胞因子检测平台-磁珠动态捕获

数字式单分子免疫分析阵列及机器算法，检测IL-6、IL-8、IL-18和血管

内皮生长因子(VEGF)在患者体内的产生水平，以此区别活动性结核病和其

他疾病，研究结果表明该检测系统的敏感度略低于WHO目标产品目录要

求，特异度超过该研究基于结核病患者体内血液中宿主蛋白表达差

70%o

异以实现结核病初诊分诊作用，后续有望开发为结核病POCT类产品。

5.基于质谱的呼气检测方法：1970年，美国化学家LinusPauling用气相

色谱仪(gaschromatograph,GC)检测到人类呼气中的200多种挥发性

有机化合物(volatileorganiccompound,VOC),可用于评估身体健康

和疾病状况。Zetola等通过分析肺结核患者呼气中VOC成分诊断肺结核

并监测肺结核治疗过程中患者呼气VOC成分变化，与对照组VOC相比,

诊断肺结核的敏感度为94.10%(95%CI:83.80%98.80%),特异度为

90.00%(95%CI:68.30%~98.80%),而肺结核治疗过程中实验组和对照

组患者的呼气VOC均有变化，但对照组的变化更显著，显示呼气检测可

作为诊断肺结核的新型工具。eNose是近几年在巴拉圭开发并使用的设备

之一，敏感度为,特异度为非侵入性的检测对于儿童和

88%92%0VOC

危重症患者诊断具有重要的意义。呼气检测技术在呼吸系统疾病诊断方面

有望成为便捷、快速、准确的潜在诊断工具。

三、国内结核病诊断领域面临的主要挑战及展望

1.我国结核病诊断领域进展与挑战并存：过去的20年尽管取得了显著的

进步，结核病诊断产品管线丰富，部分产品与国际处于并跑状态，但是需

要承认我国在结核病实验室诊断诸多领域与国际产品相比还表现出一定

的差距：首先，国内产品原创性不高，主要以跟随、仿制国外的产品为主，

缺乏核