冷冻电镜揭示生物大分子

Unravellingbiological

macromoleculeswithcryo-electronmicroscopy.目录.21.背景及简介2.样品制备3.优势4.展望1.背景及简介.3冷冻电镜〔Cryo-microscopy〕通常是在普通透射电镜上加装样品冷冻设备，将样品冷却后用于观测蛋白、生物切片的设备。.41.背景-开展历史雅克·迪波什〔JacquesDubochet〕约阿希姆·弗兰克(JoachimFrank)

查理德·亨德森(Richard

Henderson)开展了冷冻电子显微镜技术，以高分辨率确定了溶液里的生物分子结构..6当你冷冻水的时候，它常常形成冰晶；有时候，这是六边形的晶体；有时，是立方的晶体〔不透亮〕；但是，如果你非常迅速地冷冻液态水，它可以形成无定形的冰〔玻璃态冰〕。起初，他们尝试了液氮，但是液氮温度通常都处于沸点附近，冷却外表形成大量气体，冷却速度极慢，这会导致冷却之后常常得到冰晶。他设计了一个巧妙的方法，利用吸附的方式形成薄的水膜，然后快速插入到冷却液体〔处于液氮环境的液体乙烷，冷却至和液氮相当的温度〕〔注：乙烷熔点约-183°C，液氮沸点约−196°C〕。速度：10000°C/S图像处理技术.7可以把电镜下模糊的二维图像进行分析合并，从而显示出一个清晰的三维图像和三维结构1.背景及简介.8冷冻电镜技术----让人类看的更细.9主要应用：生物大分子及其复合物结构解析细胞或者组织的超微结构解析人眼分辨率0.2mm(十分之一头发丝〕光学显微镜1000倍电子显微镜100倍冷冻电镜近原子级1.背景及简介.10X衍射晶体学同一种蛋白质的多个拷贝排列成一个3D晶体时，可以通过X射线衍射实验获得关于蛋白质的原子结构的信息核磁共振光谱（NMR）测量原子之间的距离依赖相互作用。可以用来推断相对小的蛋白质的结构，并且它提供了关于蛋白质动力学及其与其他分子相互作用的独特信息。冷冻电子显微技术蛋白质散射电子的强度比X射线大一万倍，而电子可以通过几十万伏的电场加速到比蛋白质结构中原子间距离短得多的波长。此外，电子的电荷使得相对容易用电磁透镜聚焦它们。一般电镜技术在生物领域应用制约因素.111.生物样品含有丰富的水分，而投射电镜工作的条件是高度真空环境2.高能电子束会对样品造成破坏〔电压一般为300kV,200kV,120kV)3.生物样品主要组分是碳、氢、氧等轻元素，对电子的反射和散射作用与背景相比效果相似，所获图像衬度低，4.观察过程中蛋白质与电子发生相互作用或者由于温度变化而发生漂移，导致模糊.12辐射损伤意味着穿过样品的电子将破坏其化学键，改变原有结构信息〔比方蛋白、脂等等〕，将它们“烧掉〞。所以，氢键会被破坏，变成了气体，留下的只有一些结构残骸由于辐射损伤的存在，无法测定单个分子的结构。所以他提出使用晶体，通过这种方式，你可以弄清楚电子是如何和这些结构相互作用。这种情况下，你就拥有数十万个规那么排列的分子。即使其中的一局部子结构被破坏，你也可以从中得到目标分子的结构信息膜蛋白.13去除糖基化，长环和柔性区域洗涤剂优化gua.14谷氨酸脱氢酶2.样品的制备.15将几微升纯化的蛋白质溶液施加到由多孔碳膜组成的网格上，并将多余的液体吸干。栅格插入液体乙烷，瞬间冻结样品和嵌入颗粒玻璃冰。电网储存在液氮中直到它被转移到透射电子显微镜。网格孔内各种方向的蛋白质的二维图像然后被显微镜的检测器捕获。处理数据以将相同蛋白质的图像组合成蛋白质结构的3D重建。3.3D重建.163D重建最简单的一种方法“单颗粒〞法。以核糖体为例，核糖体冷冻在一个很薄的水膜中，我们可以从各个不同方向看到的核糖体的二维投影图。从照片中挑选出一个一个核糖体的“单颗粒〞；如果数量足够，比方目前大约需要1-2万个，你就可以将这些各个不同方向的核糖体信息组合，模拟得到三维结构。采集过程.17“分子随机冷冻在某个状态〞“单颗粒冷冻〞“分辨率到达2.9Å=0.29nm.18优势1.不需要结晶2.样品保存在天然环境3.可以研究亚稳态结构4.样品量少〔1μL)蛋白分子需要120kd以上，二聚体的话60kd也可以考虑〕..20冷冻电镜在动力学中的应用.21“ATP合成酶〞包含不同构象的大分子混合物展望.221.引进云计算：冷冻电镜需要采集大量数据。以核糖体为例，我们将核糖体冻在一个很薄的水膜中，能从各个不同方向看到的核糖体的二维投影，从照片中挑出一个一个核糖体的“单颗粒〞，按之前我们说的要获得它的一个三维结构，目前需要1-2万个。2.用于揭示某些疾病的生理过程。神经变性疾病为例PHDD疾病基因+加上绿色荧光蛋白基因，然后将这个报告基因转染细胞系，通过绿色荧光蛋白确定致病蛋白。利用冷冻电镜观察致病蛋白的结构，发现其是一个外表带