DB21∕T 3378-2021 辽宁省松材线虫病检验鉴定技术规程

65.020.01CCS

B

16DB

21 21/T

3378—2021辽宁省松材线虫病检验鉴定技术规程Technical

on

quarantine

the

pine

disease

in

province 辽宁省市场监督管理局 发

布DB21/T

—2021 前言

................................................................................

II1

..............................................................................

12

规范性引用文件

....................................................................

13 术语和定义

........................................................................

14

..............................................................................

25

形态学鉴定

........................................................................

27 样品监管

..........................................................................

38

检验鉴定结果反馈及疫情上报

........................................................

3附录

A（资料性） 松材线虫形态特征....................................................

5附录

B（资料性） 松材线虫病取样

......................................................

6附录

C（资料性） 常用的松材线虫分离方法..............................................

8附录

D（资料性） 临时玻片制作和线虫快速培养.........................................

10附录

E（资料性） 松材线虫与拟松材线虫形态特征的主要区别.............................

11附录

F（规范性） 松材线虫形态学检验鉴定记录表.......................................

12附录

G（资料性） 分子生物学鉴定

.....................................................

13附录

H（规范性） 松材线虫分子生物学检验送检表.......................................

16附录

I（规范性） 松材线虫检验鉴定报告...............................................

17DB21/T

—2021 本标准按照GB/T

1.1给出的规则编写。本标准由辽宁省林业和草原局提出并归口管理。省危险性林业有害生物防控重点实验室。郑英明、刘佳、张霞、杜岳纯、裴明阳、雷鸣雷。我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省林业和草原局（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话标准起草单位通讯地址：辽宁省林业发展服务中心（辽宁省林业和草原有害生物防治检疫工作站）（沈阳市和平区太原北街2号综合楼B-621），联系电话IIDB21/T

3378—20211 范围流程。本标准适用于松材线虫寄主植物及其制品检验鉴定。2 规范性引用文件文件。GB/T

23476

松材线虫病检疫技术规程GB/T

23478

松材线虫普查监测技术规程GB/T

35342

松材线虫分子检测鉴定技术规程3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准3.1松材线虫

Bursaphelenchus

xylophilus

（

et

Buhrer）Nickle属于

线虫

门

（），

侧尾

腺

纲（

），

滑

刃目

（

Aphelenchida）

，滑

刃

总科（Aphelenchoidoidea），滑刃科（Aphelenchoidoidae），伞滑亚科（Bursaphelenchinae），伞滑刃属（Bursaphelenchus）。其形态特征参见附录A。3.2松材线虫病萎蔫病、松树枯萎病。3.3松木及其制品箱、木托盘、垫木、枕木、衬木等。经人工合成或经加热、加压等深度加工的包装木质材料除外，如胶合板、纤维板等。3.4DB21/T

3378—2021检验鉴定对松科植物及其制品，通过形态学特征或分子省物学特性检验判定是否含有松材线虫的过程。3.5样品从表现出异常症状的松科植物或松木制品上选取的，用于松材线虫病检验鉴定的材料。4 取样4.1 感病松树现地取样方法

4

月

8

月

月份。具体取样方法参见附录

。4.1.1 感病松树典型症状向外扩散。远看松针颜色为褐色或亮红褐色，枯死枝条从树冠向下逐渐增多，针叶不脱落。4.1.2感病松树病症表现时间当年染病的松树一般在

8

月下旬至

月上旬表现病症，越年死亡的一般在

4

月

月表现病症。4.2 松木及其制品取样方法直接观察或借助锯、斧等工具检查松木及制品是否干枯；重量是否明显减轻；木质部是否有蓝变；样部位和数量参见附录

B.3。5 形态学鉴定5.1 分离采用贝尔曼漏斗法、浅盘法进行（参见附录C）。分离时间一般需要4h-12h。将分离液体收集到试管或者烧杯中，通过自然沉淀或使用离心机处理后得到线虫分离液。5.2 镜检将盛有线虫分离液的培养皿置于解剖镜下观察，先确认有无线虫。对有线虫的样品进行活体检验，片，再根据形态特征予以鉴别。（参见附录D）5.3 培养松材线虫。（参见附录D）5.4 形态特征DB21/T

3378—2021E般先观察线虫中的食道球形状、口针有无及口针的形状，再对其典型形态特征观察和测计后才能确定。5.5检验记录检验鉴定结果填入《松材线虫形态学检验鉴定记录表》（参见附录F）。6 分子生物学鉴定常用的分子生物学鉴定方法有松材线虫PCR检测、松材线虫自动化分子检测和实时荧光PCR检测。（参见附录G）7 样品监管7.1 样品保存4℃恒温箱，一般在1个月内完成分离检验。检验鉴定的样品保存不少于6个月，以备复检。7.2 分子生物学检验样品送检记录表，并填写松材线虫分子生物学检验送检表（附录H），报送省级检验鉴定机构登记检验。送检要有专人负责，保证样品送检安全，不能通过邮寄方式。7.3 样品销毁分离检验后的样品要采用高压灭菌、焚烧、粉碎的方式及时销毁处理。8 检验鉴定结果反馈及疫情上报8.1 检验鉴定结果反馈省级检验鉴定机构应当在收到送检样品10个工作日内出具检验鉴定报告，（报告样式参见附录I）并留档备查。8.2 检验鉴定结果确认检验鉴定结果可能为新增松材线虫病疫区和疫点时，省级检验鉴定机构应当在检验鉴定后3二次确认，确认后反馈至送检单位。8.3检验鉴定备案省级检验鉴定机构每半年需将检验鉴定开展情况上报省林业和草原行政主管部门所属的防治检疫机构备案。市、县送检的检验鉴定记录、报告等档案要保存3年以上。DB21/T

3378—20218.4 疫情上报原行政主管部门及当地人民政府。8.5 疫情信息发布国家和省级林业和草原行政主管部门按照有关规定发布疫情信息。AA

DB21/T

3378—2021附

录 A（资料性）松材线虫形态特征2/3尾尖突长1μm左右，不超过2μm。裹卵形交合伞。雌虫：A.整体；F.体前部；G.阴门区；雄虫：B.整体；C.尾部；尾端；E.交合刺BB附

录 B（资料性）松材线虫病取样

DB21/T

3378—2021B.1 取样工具电锯或手锯、砍刀或斧头、手摇钻、标签、塑封袋。B.2 现地取样方法B.2.1 取样对象优先抽取尚未完全枯死或刚枯死的松树。可参照以下特征选择取样松树：（1其它病虫危害）；（2）针叶呈现红褐色、黄褐色；（3）整株或部分枝条萎蔫、枯死，但针叶下垂、不脱落；（4）树干部有媒介昆虫的产卵刻槽或侵入孔；（5）树干部松脂渗出少或无松脂渗出。B.2.2 取样数量10株以下全部取样；10株以上的先抽取10株进行取样检验，如果检验有则不需要继续取样，如果没有要继续取样检验，直至全部取样检验为止。B.2.3 取样部位部之间）、上部（主干与主侧枝交界处）3个部位取样。对于仅部分枝条表现症状的，在其表现症状的枝条上取样。对于树干内发现媒介昆虫蛹的，优先在蛹室周围取样。B.2.4 取样方法在取样部位剥净树皮，用砍刀或斧头直接砍取100g-200g木片；或剥净树皮，用手摇钻从木质部表面至髓心钻取木屑；或者将枯死松树伐倒，在取样部位分别截取厚的圆盘等。B.2.5样品标记时间和取样人等信息。B.3 松木及其制品取样方法B.3.1 取样对象DB21/T

3378—2021品进行取样。B.3.2 取样部位和数量原木取样时在取样部位剥净树皮，直接砍取木片；或用手摇钻从木质部至髓心钻取100g-200g木屑；或分别截取2cm厚的圆盘。松木制品进行取样时可直接砍取木片；或直接带回部分松木制品。B.3.3 样品标记所取样品要及时贴上标签，标明样品编号、取样地点、松木制品名称、取样时间和取样人等信息。CC附

录 C（资料性）常用的松材线虫分离方法

DB21/T

3378—2021C.1 贝尔曼漏斗法(图C.1)在口径为的漏斗末端接一段10cm层大小适中的面巾纸。将样品去皮后劈成长约1cm-4cm，直径1cm-3cm

的细条或直接取木屑约10g置于漏斗中的面巾纸，如果有气泡可以松开止水夹放出一些水，冲掉气泡。室温不低于20℃，分离浸泡用的水温在20℃℃之间，线虫游离出一定数量后可镜检，一般需要3h-12h。要轻轻打开止水夹，用培养皿或烧杯在橡皮管下接取分离液约；或用离心沉淀管接取分离液，自然沉淀或离心。C.2浅盘法12h-24h后，将下面浅盘的分离液收集到小烧杯中，自然沉淀或离心。(图C.2)图C.1 贝尔曼漏斗法装置图DB21/T

3378—2021图C.2 浅盘法装置图DD附

录 D（资料性）临时玻片制作和线虫快速培养

DB21/T

3378—2021D.1 临时玻片制作D.1.1 杀死线虫将线虫分离液取一滴放在载玻片上，将载玻片在酒精灯火焰上来回移动，加热过度会破坏线虫体内器官或使其表皮熟化变白，影响观察。也可以将线虫分离液放在试管中，把试管放在60℃℃的水浴箱中，即可杀死线虫。D.1.2 玻片制作气泡。D.2 线虫快速培养D.2.1 疫木保温保湿培养26℃℃培养箱内培养3天，倒取杯中水液，可获得较多成虫。D.2.2单异活体培养制备马铃薯-葡萄糖-PDAcinerea)

spp.)Fusariµm

下将盘多毛孢、镰刀孢或灰葡萄孢接种在PDA平板上，盘多毛孢或镰刀孢28℃恒温培养，灰葡萄孢25℃恒温培养430℃条件下保湿培养线虫，2℃恒温培养线虫需要。10类

别松材线虫拟松材线虫雌虫尾部尖突，不超过2µm，一般为1µm圆锥形，末端有明显的尾尖突，长度在3.5µm-5µm雄虫尾部交合刺远端有盘状突，交合伞为卵形交合刺远端无盘状突，交合伞为近方形EE附

录E（资料性）松材线虫与拟松材线虫形态特征的主要区别

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3378—2021E.1 松材线虫典型形态特征图E.1 松材线虫典型形态特征前体部特征 雄虫尾部弓形雄虫尾部交合伞雌虫尾部指形 雌虫尾部短尾尖突 雌虫阴门E.2松材线虫与拟松材线虫形态特征的主要区别拟松材线虫B.muctonatus（

et

Enda）在形态学和生物学方面都与松材线虫相似，但分布较松材线虫广泛，在松材线虫病的检验中常常可见，二者在形态上的主要区别在于：(表E.1)表E.1表E.1松材线虫和拟松材线虫形态特征主要区别样号采样地点天牛栖居痕迹线虫松材线虫检验日期检验人FF

DB21/T

3378—2021附

录 F（规范性）松材线虫形态学检验鉴定记录表表F.1 松材线虫形态学检验鉴定记录表检验单位：

日期：

检验单位：

日期：

12GG附

录 G（资料性）分子生物学鉴定

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3378—2021G.1 松材线虫G.1.1 线虫基因组DNA的提取制

作

线

虫

裂

解

液

(200mmol/LTris-HC1

、

、

、

、2%β、200μg/mL蛋白酶L线虫裂解液：1线虫与裂解液置于离心管中。置于PCR仪，70℃条件下保温处理，在95℃条件下保温处理后，离心，取上清液。G.1.2 反应体系每反应的混合液总体积为20μL，其中：（1）2.0μL

10×

PCR

缓冲液；（2）

2.5mmol/L的dNTP；（3）0.3μL快速扩增Taq（4）1.5μL

10mmol/L的引物组合B；（5）2.0μL的模板DNA；（620μL。G.1.3 反应程序反应混合液在℃预变性，进入循环98℃变性3s，52℃退火3s，72℃延伸40s，共30个循环，最后72℃延伸。G.1.4 结果检测PCR

扩增产物在1.5

%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为或1×TBE，电压为5V/cm，电泳时间为。置凝胶于302nm透射紫外灯上观察，拍照。结果参见图G.1。图

G.1

松材线虫电泳检测图谱M-

47-4950-52G.2 松材线虫自动化分子检测13序号颜色组别样品来源Ct

值判定结果11A125.83含松材线虫21A220.23含松材线虫31A328.47含松材线虫41A423.19含松材线虫51A527.38含松材线虫61A621.28含松材线虫71阳性对照16.65含松材线虫81阴性对照不含松材线虫名

称数

量成

分DNA

提取试剂A液2

ml/管×1管松材线虫裂解缓冲液DNA

提取试剂B液200µl/管×1管松材线虫消化酶pCR扩增混合K液500µl/管×1管含Taq

DNA聚合酶，dNTP的溶液PCR扩增混合P液150µl/管×1管特异性引物、探针线虫阳性质控Y液75µ管×1管松材线虫阴性质控C液1ml/管×1管无酶水DB21/T

3378—2021G.2.1 松材线虫病试剂盒组成成分G.2.2G.2.1 松材线虫病试剂盒组成成分松材线虫自动化分子检测系统48，松材线虫自动化分子检测系统48A，松材线虫自动化分子检测系统mini等松材线虫荧光定量

PCR

检测系统。G.2.3 检测方法B将分离的线虫置于20μL，加入A液20μL，液℃，B，95℃，；离心，取上清液（线虫DNA溶液）。G.2.4 反应体系样品：线虫DNA3.5μL，加入K液5μL，P液1.5μL。阳性对照：线虫DNA阳性质控Y液3.5μL，加入K液，P液1.5μL。阴性对照：阴性质控C液3.5μL，加入K液5μL，P液1.5μL。G.2.5 反应程序将样品、阳性对照及阴性对照放入机器，选择仪器中松材线虫自动检测程序。G.2.6反应结果松材线虫自动化分子检测系统采用自动程序判读检测结果，如表、。表G.1表G.1 松材线虫