ucp2-试验站基因多态性与腹型肥胖的关联

ucp2-试验站基因多态性与腹型肥胖的关联

腹部肥胖的出现与营养、饮食和体育等后因素有关，遗传因素也起着重要作用。多个微效基因的作用累加影响着个体对腹型肥胖的易感性。解偶联蛋白2基因(uncouplingproteins2,UCP2)与固醇调节元件结合蛋白1c基因(sterolregulatoryelementbindingproteins1c,SREBP1c)多态性与腹型肥胖的关系是近年被广为关注的问题。解偶联蛋白参与机体的能量代谢,尤其是增加机体脂肪细胞中的能量消耗。固醇调节元件结合蛋白是真核细胞内调节脂质合成的关键核转录因子,调节多种代谢酶的活性。有报道,UCP2和SREBP1c基因多态性均与腹型肥胖关系密切,也有研究阐述,SREBP1c也可以刺激UCP2基因的表达。鉴于目前相关问题的流行病学研究较少,为探索UCP2基因与SREBP1c基因多态性与腹型肥胖的关系,考虑到腹型肥胖患者在2型糖尿病家系中有着较高程度的聚集,而且家系资料有利于避免各种已知与潜在混杂因素的干扰,能够较可靠地分析基因与表型的关联,我们开展了本项流行病学家系研究。本研究开始前已经过北京大学生物医学伦理委员会审查批准(2005年)。1数据和方法1.1患者性别、年龄及家系研究对象包括先证者及其同胞和父母。从北京房山区第一医院入院的2型糖尿病患者中选择符合本研究入选标准的先证者并追踪其同胞与父母的情况。先证者的入选标准为:(1)符合WHO关于2型糖尿病的诊断标准;(2)年龄在30岁以上,户口在本地,且在房山地区居住时间满5年以上。(3)签署了知情同意书。排除标准包括:(1)处于急性感染、创伤等应激状态者;(2)实验检测得知属于线粒体突变相关糖尿病者;(3)经系谱分析结合发病年龄认为可能属于MODY(maturityonsetdiabetesoftheyoung)者;(4)有严重疾病、意识不清、不能配合者。2型糖尿病先证者的家系定义为2型糖尿病家系。先证者的同胞和父母应符合上述先证者入选标准中的第(2)和(3)条及排除标准的第(4)条。同一家系的证实依据户籍登记、乡村医生与知情者的证明。1.2调查和测定研究对象首先确定先证者,进一步追踪其符合条件的父母和全部同胞。对所有研究对象(包括先证者、同胞和父母)进行问卷调查、体格检查与血样采集。分离血样标本之后分别进行血清学指标的检验与基因组DNA的提取。1.3疾病表型的定义调查表的内容涉及一般社会人口学特征、疾病史、家庭史、生活习惯(吸烟、饮酒、体育锻炼、膳食)等。调查表中相关行为因素定义与本研究组相关研究相同。检测的血清学指标主要包括:空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇等,依不同指标分别使用日本日立公司生产的7180型全自动生化分析仪与美国雅培公司生产的AxSYM型全自动免疫荧光分析仪。本研究中相关疾病表型定义如下:(1)腹型肥胖定义为男性腰围≥90cm或女性腰围≥80cm;(2)高血压定义为3次测量平均收缩压≥140mmHg(1mmHg=0.133kPa)或平均舒张压≥90mmHg或正在服用抗高血压药物;(3)血脂异常定义为总胆固醇≥5.72mmol/L或甘油三酯≥1.70mmol/L或低密度脂蛋白胆固醇≥3.64mmol/L或高密度脂蛋白胆固醇<0.91mmol/L;(4)冠心病与脑卒中患者需要具有二级以上医院的明确诊断。1.4ucp2基因-126a/g多态性pcr扩增本研究应用酚-氯仿法通过标准程序提取血凝块白细胞DNA。基因分型采用多聚酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)联合限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)的方法。PCR引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。UCP2基因-866A/G多态性PCR反应的正向引物序列为5′-CACGCTGCTTCTGCCAGGAC-3′,反向引物序列为5′-AGGCGTCAGGAGATGGACCG-3′。PCR扩增条件为:96℃预变性5min,接着进行95℃变性30s、68℃退火30s、72℃延伸30s,共35个循环,最后72℃延伸7min。MluⅠ37℃酶切PCR产物12h,酶切产物进行2.5%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后凝胶成像系统拍照并判读基因型。SREBP1c基因54G/C多态性PCR反应的正向引物序列为5′-TCCTGTGCTACTTTGCCTTTT-3′,反向引物序列为5′-GGACAGAGCTGGGAGGTG-3′。为提高PCR反应的特异性,采用touchdownPCR的方法进行基因扩增。XmnⅠ37℃酶切PCR产物12h,酶切产物进行2%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后凝胶成像系统拍照并判读基因型。1.5回归分析和效应强度估计在本研究中,正态分布的连续性变量用x¯±sx¯±s表示,组间均数比较采用成组t检验;非正态分布的连续性变量用中位数(四分位数)表示,组间比较采用Wilcoxon秩和检验。分类变量用频数(构成比)表示,组间分布比较采用卡方检验。本研究使用广义估计方程(generalizedestimatingequation,GEE)进行回归分析与效应强度的估计。以上统计分析过程在SAS9.13软件中完成。2结果2.1腹型肥方案与基因型鉴定本研究共募集到284个2型糖尿病家系,共762名研究对象。表1显示了研究对象(包括先证者、同胞和父母)的人口学特征与疾病相关行为因素的分布。从表1中可见,腹型肥胖组与非腹型肥胖组间年龄未见统计学差异,而性别构成差异显著,腹型肥胖组女性的构成比显著高于男性。两组间吸烟、饮酒、体育锻炼个体的构成比有统计学差异。2型糖尿病、高血压、血脂异常的患病率在腹型肥胖组也显著高于非腹型肥胖组。腹型肥胖组中,体重指数(BMI)、腰围、收缩压、舒张压、血浆甘油三酯、总胆固醇及LDL胆固醇水平显著高于非腹型肥胖组,而HDL胆固醇水平显著低于非腹型肥胖组(P<0.05)。所有762名研究对象均成功鉴定基因型。UCP2-866A/G多态性的等位基因A的频率为0.459、等位基因G的频率为0.541。SREBP1c54G/C多态性的等位基因G的频率为0.822、等位基因C的频率为0.178。UCP2-866A/G与SREBP1c54G/C多态性在该人群中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.226,0.500),这表明本研究人群为遗传平衡的群体。1mmHg=0.133kPa.2.2腹型基肥与常见慢性病的关系为了有针对性地控制与腹型肥胖相关的慢性病影响,得到腹型肥胖与所研究的基因多态性的真实关联,我们首先分析了腹型肥胖与常见慢性病的关系。表2显示了以腹型肥胖为自变量,相关疾病为因变量,调整年龄、性别、吸烟、饮酒、体育锻炼等混杂因素进行的GEE回归分析,结果表明,腹型肥胖与2型糖尿病(OR=1.5,P=0.013)、高血压(OR=2.7,P<0.001)、血脂异常(OR=3.6,P<0.001)有关。2.3保健型组与配合性组的腹型肥联合作用表3显示了两个基因多态性的基因型在研究人群中的分布以及腹型肥胖与基因型的关联情况。从结果中可见,在调整了年龄、性别、吸烟、饮酒和体育锻炼以及表2中所示与腹型肥胖相关的2型糖尿病、高血压、血脂异常等因素后,UCP2基因-866A/G多态性与腹型肥胖相关(OR=1.8,P=0.010),SREBP1c基因54G/C多态性也与腹型肥胖相关(OR=1.6,P=0.028)。Generalizedestimateequationmodelwithadjustmentforage,sex,physicalexercise,cigarettesmoking,alcoholdrinkingandintra-familycorrelations.表4显示了UCP2-866A/G与SREBP1c54G/C两个多态性对腹型肥胖的联合作用,其中OR表示不同基因型组合与参照组(AA/GG组合)相比的原始比值比与经年龄、性别、体育锻炼以及表2中所示与腹型肥胖相关的2型糖尿病、高血压、血脂异常等因素调整后的比值比。由表中数据可见,单纯SREBP1c54G/C为突变型(GC/CC)而UCP2-866A/G不为突变型(AG/GG)者与参照组相比患腹型肥胖的OR值为1.2,但没有统计学意义(P>0.05);单纯UCP2-866A/G为突变型而SREBP1c54G/C非突变型者与参照组相比患腹型肥胖的OR值为1.8,有统计学意义(P=0.042)。两个多态性位点同时为突变型时,与参照组相比患腹型肥胖的OR值为3.2,有统计学意义(P=0.001)。图1是以性别分组,对4种基因型组合群体腹型肥胖的患病率作图。从图中可见,两种多态性对腹型肥胖的联合作用在男性群体与女性群体中都有所体现,但男性群体中的作用更加显著。Generalizedestimateequationmodelwithadjustmentforage,sex,physicalexercise,cigarettesmoking,alcoholdrinking,hypertension,dyslipidemia,type2diabetesandintra-familycorrelations.3u2004相关统计数据相关因素是受共混合者采用家系人群候选基因的关联研究可以避免人群分层(populationstratification)所带来的混杂,所得到的结果比较可靠,出现假阳性结论的可能性较小。由于同一家族中多个成员参与研究,可以通过统计软件来进行家族成员基因型信息的孟德尔检错,而一般人群的基因分型资料则不能进行此类检错,所以家系研究的基因型信息的准确程度相较人群资料而言更易得到保证。考虑到同一个家系内部成员之间的相关性,不符合一般线性回归或logistic回归对于观察记录之间相互独立的要求,所以效应强度的估计和对混杂因素的控制不能直接用一般线性回归或logistic回归分析,本研究采用GEE模型进行分析。GEE模型是广义线性模型(generalizedlinearmodel,GLM)的推广,通过观察相关性的工作矩阵来拟合广义线性模型中存在不确定相关关系时的参数。本研究中的单因素回归分析及联合作用的回归分析均采用了GEE回归模型来控制家族内部成员的相关性,同时控制其他可能的混杂因素。GEE回归模型相关性工作矩阵应用可互换(exchangeable)的类型,即只适用一个自由度,检验效率较高。解耦联蛋白的主要生物学功能是作为承担转运质子穿过线粒体内膜的载体蛋白,消除线粒体内膜的质子电化学梯度,使线粒体呼吸作用中的氧化磷酸化解偶联,能量以热能的形式释放,而不以ATP形式储存,从而参与调节机体的能量代谢。UCP2启动子区域-866A/G多态性可以影响基因的转录活性,从而与机体肥胖,糖、脂代谢异常有关。固醇调节元件结合蛋白调控的基因主要有以下几类:与胆固醇和脂肪酸合成相关的酶类基因、在脂质分解代谢和细胞内转运中发挥重要作用的蛋白质的基因、某些分泌蛋白(如瘦素)的基因。SREBP是调控细胞内脂肪积聚的关键,其表达异常可能引起组织脂质代谢紊乱,继而引发肥胖等疾病。目前已知SREBP有3种异构体:SREBP1a、1c和2。很多证据表明,SREBP在肥胖、动脉粥样硬化、脂代谢紊乱、糖尿病及其并发症中发挥着重要的调控作用。本研究发现,单纯SREBP1c54G/C为突变型者与参照组相比患腹型肥胖的OR值没有统计学意义,单纯UCP2-866A/G为突变型者与参照组相比患腹型肥胖的OR值为2.0,有统计学意义,这些研究结果与既往研究相一致。有研究发现SREBP1c基因54G/C多态性与2型糖尿病和病态肥胖有关。Generalizedestimateequationmodelwithadjustmentforage,sex,physicalexercise,cigarettesmoking,alcoholdrinking,hypertension,dyslipidemia,type2diabetesandintra-familycorrelations.本研究显示,在控制了年龄、吸烟、饮酒等混杂因素之后,腹型肥胖仍与2型糖尿病、高血压、血脂异常有关,这表明腹型肥胖是这3种疾病的独立危险因素。为确定基因多态性与腹型肥胖的关联,控制了混杂因素及相关疾病后的分析结果表明,当两个多态性位点同时为突变型时,与参照组相比患腹型肥胖的OR值为3.2,有统计学意义。这提示SREBP1c54G/C与UCP2-866A/G两个基因多态性的联合作用可能与腹型肥胖表型相关