急性心肌缺血对犬左室心肌楔形组织块io、动作电位时程和dr的影响

急性心肌缺血对犬左室心肌楔形组织块io、动作电位时程和dr的影响

冠状动脉粥样硬化和心肌缺血恶化是心脏猝死（scd）的主要原因，约占scd的70%。近年来发现其发生与心室的复极异质性和电不稳定性密切相关。心肌缺血引起心肌细胞结构、代谢及离子通道的异质性变化,从而引起心肌电生理异质性改变,包括瞬时外向钾电流(Ito)在外膜与中层、内膜的差异增加,产生J波和ST抬高;外膜比中层和内膜动作电位时程(APD)缩短明显,与内膜的APD的差值增大,即跨壁复极离散度(TDR)增大,发生2相位折返,是发生室性心动过速、心室颤动等心律失常的基础。本研究建立冠状小动脉灌注犬左室心肌组织块心肌缺血的模型,应用内、中、外3层心室肌浮置玻璃微电极和心室内外跨壁心电图同步记录技术,对比观察急性心肌缺血对心肌组织Ito、APD和TDR的影响,探讨急性心肌缺血致心律失常的机制。1材料和方法1.1急性心肌缺血模型的建立11只成年杂种家犬,雌雄不拘,体重16～18kg(由西安交通大学动物中心提供)制备冠状小动脉灌流犬左室心肌楔形组织块电生理模型;待模型和记录条件稳定0.5～1h后,应用浮置玻璃微电极和心电图同步记录技术,同步记录正常台氏液灌注状态下内、中、外3层心肌细胞的跨膜动作电位(AP)和跨壁心电图;停止冠状动脉内台氏液灌流,并向肌浴槽内改充95%N2、5%CO2混合气,造成组织块急性缺血,在急性组织缺血后第5、10、20min分别重复同步记录以上参数。同样方法造成急性心肌缺血模型后,将组织块分层,用酶解法进行细胞分离,并记录Ito。观察指标:①缺血前后的Ito变化;②APD变化:以90%复极时的APD(APD90)计算;③TDR:同一部位3层心肌中最长APD与最短APD之差(APDmax-APDmin)。1.2统计分析方法所有数据以x¯±sx¯±s表示,用Chart4.0和SPSS软件包进行统计分析,两组之间比较采用t检验,多个样本均数之间的比较采用方差分析,两两比较采用q检验。2结果2.1i-v曲线上直直机关极化法正常条件下,Ito在-30～-20mV激活,随着实验电压去极化而持续增大,I-V曲线接近直线。急性心肌缺血各阶段3层心肌细胞的Ito(TP=+70mV)的变化见表1。2.2心肌细胞apd和tdr的变化冠状小动脉灌流犬左室心肌组织块,急性无灌流心肌缺血不同缺血阶段3层心肌细胞APD均表现为APD90缩短、除极幅度(APA)降低、Vmax减小。内膜和中层心肌细胞的“峰-圆顶”形态逐渐消失。但是三者AP变化的程度和快慢各不相同,外膜心肌细胞AP的“峰-圆顶”在缺血早期较明显,很快变小消失,APD随之缩短;缺血20min后,3层心肌细胞的变化均趋于稳定(图1)。急性心肌缺血各阶段3层心肌APD及TDR的变化见表2。表2中,同种细胞各时点两两相比,除外膜心肌细胞缺血10min与缺血20min比较差异无统计学意义(P>0.05)外,其余均差异有统计学意义(P<0.05)。不同种细胞相同缺血时点比较中层心肌细胞与内膜心肌细胞之间的APD90差异无统计学意义(P>0.05)外,其余两两之间均差异有统计学意义(均P<0.01)。缺血5min与缺血20minTDR比较,P<0.01,其余各时点两两比较,均P<0.05。2.3各层心肌细胞apd90缩短白区率的比较急性心肌缺血各时点3层心肌细胞APD90缩短百分率的比较见表3。2.4室性心动过速发生率在冠状小动脉灌注犬左室心肌组织块急性无灌流心肌缺血20min内“R-onT”室性期前收缩的发生率为7/11(63.6%),“R-onT”室性期前收缩起源于中层或外膜心肌细胞;室性心动过速(VT)的发生率为5/11(45.5%)(图2、3)。急性缺血早期心室颤动的发生率为1/11(9.1%)。3讨论3.1电导联体测定心肌组织状态本实验在冠状小动脉灌流犬左室心肌组织块建立了急性心肌缺血电生理模型,使跨室壁横断面的3层心肌细胞保留在同一个标本中,保留了3层不同心肌细胞间的电耦联作用,可以反映整体心肌组织的状态;应用浮置标准玻璃微电极技术同步直接记录3层细胞的跨膜动作电位及跨壁心电图,将细胞水平的电活动与整体心肌组织生物电活动结合,可以用于研究各种心电现象及心律失常的细胞机制,是目前国际上一种先进的广泛推广应用的研究心肌和药物电生理机制的实验方法。3.2ito的历史表达Ito由Ito1及Ito22个亚组构成,而Ito在3层心肌中的差别十分显著,心内膜中Ito1仅为心外膜及中层细胞中的1/6～1/5。当Ito1被选择性阻滞后,外膜和中层心肌细胞的AP的1相“峰-圆顶”形态消失,表明了Ito与复极早期“峰-圆顶”现象之间的密切相关性。应用常规微电极技术及膜片钳技术发现Ito主要存在于动物的外膜下心肌细胞,而在内膜下心肌细胞离子流密度很小或无。由于离子通道密度的不同,使AP形态产生了差异。在急性心肌缺血时,心外膜Ito明显比心内膜增大,导致内外膜之间在1相电位差增大,形成J点抬高和J波形成,内外膜之间在2相电位差形成ST段抬高,表现为典型的急性心肌缺血超极期的心电图改变。本实验比较了3层心肌细胞的Ito(TP=+70mV),外膜和中层心肌细胞电流密度明显大于内膜心肌细胞,而且Ito具有明显的慢频率依赖性。缺血时3层心肌细胞的Ito均明显增大,以外膜Ito峰电流增大最明显,中层心肌细胞最少,是产生上述心电图特征的离子流机制。类似的实验结果也证明了急性心肌缺血时触发心室颤动是由于心外膜Ito明显增大,APD明显缩短,而引起的2相位折返所致。3.3心肌细胞apd、apa、vmaa的跨室壁传导的不均一性变化目前缺血对单细胞作用的研究,多用高钾、低氧、低pH值(酸中毒)的台氏液灌流模拟缺血,电流钳技术记录跨膜动作电位。多数研究结果发现:缺血后,外膜心肌细胞的APD缩短更为明显,静息膜电位去极化更显著。但也有少数研究发现模拟缺血前后内外膜心肌细胞APD的缩短程度无差异。本实验结果显示外膜心肌细胞急性缺血10min内,外膜心肌细胞APD缩短较中层和内膜心肌细胞明显,从而使TDR明显增大;中层心肌细胞APD的变化介于内外膜之间。由于内、中、外3层心肌细胞APD、APA、Vmax的不均一变化,不仅TDR增加,跨室壁传导亦发生不均一性变化,两者构成了折返的基础。Gilmour等用分离的心外膜、心内膜组织条作为标本,高钾、低氧、低pH值灌流液灌流模拟缺血,应用标准玻璃微电极技术同步或不同步记录内外膜心肌细胞动作电位,发现心外膜细胞的APD缩短、0相APA降低、Vmax减小、激动时间延长比内膜、浦肯野纤维更为明显,兴奋性丧失的发生率更高。Robert采用Langendorff灌注心脏,应用吸附电极记录内、外膜单向动作电位(MAP),停止主动脉逆行灌注后,外膜单向APD缩短更为明显。体内心脏实验,通过结扎阻断某支冠状动脉(如左前降支、对角支或回旋支,视动物种类和大小而定)造成远端心肌缺血,利用吸附电极或富有弹性的接触电极记录的内、外膜MAP,阻断多数冠状动脉造成缺血区MAP缩短更明显。用期前收缩刺激法测定有效不应期(ERP),也发现缺血使外膜的ERP缩短更明显。我们应用冠状小动脉灌流犬左室心肌组织块标本,既保留了跨壁不同细胞间的电耦联作用;又可直接同步记录到跨室壁内、中、外3层心肌细胞的跨膜AP。结果发现3层心肌细胞APD90缩短不同造成TDR增大,说明急性心肌缺血过程中,3层心肌细胞复极变化的不同步,也是TDR增大的原因之一。从本实验的结果看,TDR在缺血5～10min时达到最大,这与以往的研究发现急性缺血Ⅰa期(缺血2～10min)发生室性心律失常的主要机制是2相位折返相一致。3.4心肌缺血与相位折返我们应用冠状小动脉灌流犬左室心肌组织块标本,同步记录跨室壁内、中、外3层心肌细胞的跨膜AP和跨壁ECG的变化。结果显示,急性缺血20min,整体心肌组织块室性期前收缩发生率为63.6%,可以出现“R-onT”室性期前收缩和VT。“R-onT”室性期前收缩起源于中层和外膜心肌细胞,由早期后除极引起,并能触发持续性VT;VT持续过程中可见由外膜到中层心肌细胞的传导阻滞,说明2相位折返参与了VT的维持。而TDR增大正是产生2相位折返的基础之一。目前的研究认为,缺血性心律失常的发生机制包括:触发活动、折返活动、自律性升高。但这3个方面各自在缺血性心律失常和缺血再灌注性心律失常的发生中的侧重点不同,折返机制在缺血性室性心律失常发生中占有重要地位,尤其在急性心肌缺血阶段。在急性缺血期的Ⅰa期(缺血2～10min)VT的发生机制主要是折返活动起作用。TDR增大可以诱发折返性室性心律失常。最近,应用AP荧光标测技术在楔形组织块切面上证实,在急性缺血及再灌注过程中产生了跨壁折返。本实验采用冠状小动脉灌流犬左室心肌组织块标本,建立急性无灌流心肌缺血模型发现,跨壁TDR增加,容易在中层和外膜心肌出现早期后除极,触发的“R-onT”室性期前收缩,TDR在急性缺血10min内增大,发生2相位折返而形成心室颤动或VT。我们的研究结果说明了,急性缺血Ⅰa期,TDR增大,是诱发早期后除极、“R-onT”室性期前收缩产生和VT持续的基础。3.5外膜心肌细胞与pad的相关性近年有关急性缺血过程中室壁不同层次心肌电生理反应差异的研究中,也初步探讨了外膜心肌细胞对缺血更为敏感的电生理机制。Lukas等的研究中,用4-amnopyridine(Ito抑制剂)预处理前模拟缺血使外膜心肌细胞的AP平台期消失,APD90缩短了50%～60%,而内膜心肌细胞的APD90仅缩短10%～20%,APD离散度增加,4-amnopyridine预处理后,使外膜心肌细胞AP平台期恢复,显著缩小了内外膜APD离散度。说明外膜缺血易感性与外膜心肌细胞存在较内膜细胞更显著的Ito有关。Miyoshi等记录体内心脏MAP的研究中,KATP抑制剂5-hydroxydecanoate预处理更明显地抑制缺血导致的外膜心肌APD缩短,而对心内膜作用较小,从而使内外膜之间的复极离散度减小。相反KATP激动剂nicorandil预处理则加强