中国人leber遗传病线粒体dna3个原发致病基因突变位点的谱分析

中国人leber遗传病线粒体dna3个原发致病基因突变位点的谱分析

遗传因素的leber性神经病变（lhon）是母系遗传因素引起的盲性神经疾病，其特点是青少年急性和亚急性中央视觉障碍。该病是由线粒体DNA(mtDNA)突变所致,至今已报道的相关mtDNA突变有近20种,其中90%～97%的LHON由G11778A、G3460A或T14484C3个原发致病突变中的一个所致。不同种族各种原发致病突变位点分布情况不同,白种人中90%以上的LHON患者有G3460A、G11778A、T14484C位点中的一种突变,欧洲患者的这3种突变率分别占15%～25%、50%～70%、15%[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13];亚洲人群LHON家系中G11778A位点突变率很高,占90%以上;中国人群中LHON患者的G3460A、T14484C点突变率还未被确定。为了了解中国人LHON患者的突变频谱,我们检查了140例无血缘关系的LHON患者先证者的G3460A、G11778A、T14484CmtDNA位点突变的分布情况,以确定中国人LHON患者原发致病突变频谱。1对象和方法1.1病例选择选择原因一般在性别间不同140个LHON家系的先证者选自中山眼科中心1996～2002年门诊与住院患者及外院送检的病例。其中57例有LHON家族史,占40.7%;另83例为散发病例,占59.3%。140例LHON患者中,120例为男性,占85.7%;20例为女性,占14.3%。患者发病年龄为7～40岁,平均年龄19.3岁。由于目前没有明确的临床诊断标准,因此以基因诊断确诊。眼科检查:无痛性、急性或亚急性双眼视力相继下降,初诊时最佳矫正视力为光感～0.6。所有患者均有视神经异常,急性或亚急性视神经炎和视神经萎缩,排除其它原因引起的视神经病变。未见其它神经系统和心脏异常。详细询问家族史,确定患者母系血缘亲属及其LHON患者。征得知情同意后抽取先证者和母系血缘亲属外周静脉血。对照组20人来自视力及眼部检查正常的人群,其中男性13人,女性7人,年龄17～29岁,平均年龄20.6岁。1.2方法1.2.1pcp和taqcda聚合酶用常规酚氯仿方法,从患者和正常人外周血中提取DNA,进行PCR扩增。PCR反应总体积为50μl,每种dNTP终浓度为200μmol/L、每对引物终浓度为0.25μmol/L,TaqDNA聚合酶1.5U(日本TaKaRa公司产品),95℃预变性5min。94℃变性45s,55℃退火60s,72℃延伸1min30s,循环30次,最后72℃延伸5min。检测3种突变的引物(表1)。1.2.2琼脂糖凝胶电泳取8μl的PCR扩增产物,在2%(W/V)琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭),用电压降5V/cm电泳30～45min,紫外灯下直接观察DNA带纹。1.2.3聚丙酰胺凝胶法PCR产物稀释2～4倍,然后与等体积2倍加样缓冲液(97%甲酰胺,20mmol/L乙二胺四乙酸,0.05%溴酚蓝及二甲苯氰)混合,于96℃变性5min后置于冰上冷却5min,然后立即取2～4μl混合物分别在6%和8%的聚丙酰胺凝胶(40cm×30cm×1mm,含10%甘油)于室温下或15℃下30W电泳8～9h。凝胶用银染显色后分析DNA带纹。1.2.4聚丙酰胺凝胶电泳PCR产物经2%(W/V)琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭)电泳确认后,取5μl加2USau3AI,37℃消化3～4h,消化产物在8%的聚丙酰胺凝胶30W电泳1～2h。凝胶用银染色法显色后分析DNA带纹。1.2.5dna测试序列经SSCP分析异常条带作DNA测序。片段经纯化后,经自动测序仪测序。2致突变患者的历史年龄在140例LHON先证者中,130例(92.9%)为G11778A位点突变,男113人,女17人;2例(1.4%)为G3460A位点突变,男1人,女1人;8例(5.7%)为T14484C位点突变,男6人,女2人。无先证者携带1个以上突变位点。140例LHON先证者的3个原发致病位点突变均为纯合突变。在140例3个原发致病位点突变的LHON先证者中,57例有家族史,占40.7%。其中53例为G11778A位点突变,占G11778A位点突变患者总数的40.8%;4例为T14484C位点突变,占T14484C位点突变患者总数的50.0%。MSP-PCR琼脂糖凝胶电泳分析结果:4、5、6泳道均可见G3460A突变阳性条带;8、9泳道可见G11778A突变阳性条带(图1)。PCR扩增产物经HA-SSCP分析结果:与对照组相比,3、4、5、6、7泳道均见异常条带(图2)。限制性内切酶Sau3AⅠ酶切后电泳分析T14484C位点结果:2、3、4泳道显示T14484C突变阳性,其余为阴性(2、3、4失去酶切位点,不能被切割;5、6、7、8被切割成190bp和18bp2个片段,其中18bp片段已出胶)(图3)。DNA荧光自动测序结果:G11778A位点突变G→A(图4a),G3460A位点碱基突变G→A(图4b),T14484C位点突变T→C(图4c)。3不同种人的tcda基因突变1871年德国眼科医生Leber首先描述了一种遗传性眼病,主要表现为双眼急性或亚急性中心视力下降,常累及青年男性。随后便将此病命名为LHON。该病遗传方式特殊,仅通过母系遗传,现在确认此种遗传是由于线粒体组DNA发生了突变。自G11778A位点突变被报道后,又发现了近20种mtDNA突变位点。基于遗传、临床表现、生化等研究,其中G11778A、G3460A、T14484C3个位点突变被认为是原发性突变,可以单独致病,他们的表达会大大增加致盲的可能性。而且未在正常人群中发现。它们分别导致ND1、ND4、ND6线粒体基因编码呼吸链复合物I亚单位的7个基因中的3个基因的改变。其它突变被认为是继发性突变,可在正常人群中存在,但频率远低于LHON患者。在不同人种中,G11778A突变平均占LHON患者的40%～90%,被认为是最常见的原发突变。在白种人LHON患者中此突变常见,而且G11778A突变的家系中约80%患者是男性。但是在不同人种中其频率不同,G11778A突变占白种人患者突变的50%以上。Mackey等曾报道:G11778A突变占澳大利亚或新西兰患者75%,英国或北爱尔兰患者72%,荷兰患者60%,丹麦患者86%,芬兰患者50%。而在亚洲G11778A约占LHON患者的90%,G11778A的亚洲家系中79%是男性。G3460A、T14484C所占比例却很少。在亚洲人中,G11778A位点突变在日本患者中约为87%,而G3460A、T14484C突变率分别为4%、9%。中国人群中,LHON患者的G3460A、T14484C位点的突变虽有少量报道,但突变率还未被确定。我们对140例中国人LHON先证者进行mtDNA3个原发致病突变G11778A、G3460A和T14484C位点的突变情况,发现其突变率分别为92.9%、1.4%和5.7%,与日本、中国台湾和南韩作者报道的大致相同。而在白种人中,3种原发性突变分别占50%～70%、8%～25%、10%～15%。说明LHON患者3种mtDNA原发性突变的频谱存在着种族差异。传统认为LHON与家族遗传有关,但是现在看来有许多病例都是散发病例。在白种人中,3种原发突变并且伴有家族史的比例分别为:G3460A突变中有71%～78%有家族史,G11778A中有43%～53%,T14484C中有65%～100%有家族史。而该比率远远高于日本人,在日本人中,有家族史的占45.6%,对于G3460A,G11778A,T14484C3种突变伴有家族史