家族性低钾型周期性麻痹基因的筛查

家族性低钾型周期性麻痹基因的筛查

核电站低钾周期性麻痹（hypkamase，hyp）是一种正常染色体的显性遗传疾病，发病率为1.105。该病分为家族性和散发性2型,西方国家以家族性多见,亚洲各国以散发性多见。其临床特征为发作性肌无力伴随血清钾浓度降低,肌无力经常涉及四肢,严重患者可死于呼吸肌麻痹或血清钾浓度降低所致的心律失常。近年来,通过遗传学、分子生物学和电生理学的联合研究发现,HOKPP是由离子通道基因突变所致的离子通道病,涉及的离子通道基因主要有CACNA1S、SCN4A、KCNE3(分别编码骨骼肌电压门控钙通道α1亚单位、钠通道α亚单位和钾通道辅助亚单位MiRP2)。目前已发现CACNA1S存在R528H/G、R1239H/G突变(位于外显子11和30),SCN4A基因存在R669H、R672H/G/C/S突变(位于外显子12)和P1158S突变(位于外显子19)。有报道编码骨骼肌钾通道辅助亚单位MiRP2基因KCNE3的R83H突变也与HOKPP相关,但此结论尚存在争议。与CACNA1S突变相关的HOKPP被定义为Ⅰ型,与SCN4A突变相关的HOKPP被定义为Ⅱ型。西方国家统计Ⅰ型HOKPP约占患病人数的69.0%,Ⅱ型约占8.6%,约22.4%没有找到相关突变。HOKPP不仅具有基因异质性,同时具有表型异质性。不同突变的临床表型,包括首发年龄、发作时血清钾水平、发作持续时间、持久性肌无力的发生率、性别外显率、对药物的反应等都不尽相同。而且,不同种族在突变好发位点以及相同突变的临床表型方面也存在差异。我们对中国家族性HOKPP患者进行HOKPP相关候选基因的筛查,旨在明确中国HOKPP的致病基因位点以及基因型和临床表型的相关性。数据和方法1.发作性四下肢无力风险为2002—2005年在我院门诊和住院部就诊的14例有阳性家族史的HOKPP先证者以及其中3例阳性先证者的家系中的4例其他患者和34名健康亲属。患者均表现为发作性四肢无力伴有血清钾降低。所有先证者均行血生化、血气分析、甲状腺功能、甲状腺及肾上腺B超、尿常规等检查,排除了甲状腺功能亢进、肾小管酸中毒等继发性HOKPP。2.所有患者及其家人均签署知情同意书，收取三分之一之三的周游世界ml,应用SigmaDNApurificationkit试剂盒提取基因组DNA。3.pcr扩增及活性物质合成CACNA1S基因外显子11、30,SCN4A基因外显子12、19和KCNE3基因外显子1包括了目前已知的可导致HOKPP的相关突变位点。5对引物来源于文献,利用PCR技术扩增以上3个基因的5个外显子,引物由奥科生物工程技术公司合成。PCR反应体系25μl,含DNA50ng,引物0.2μmol/L,dNTPs200μmol/L,TaqDNA聚合酶1U(日本TaKaRa公司)。反应条件:在Cetus2400热循环仪(美国PE公司)中,变性94℃5min;变性94℃40s,退火温度由具体引物决定(表1);延伸72℃60s,循环35次;延伸7min。应用2%琼脂糖电泳检测PCR产物的质量,用PCR纯化试剂盒(申能博采生物技术公司)纯化PCR产物,去除引物及Taq酶。4.使用美国制造的abiprim377DNA测序仪对纯化后的PCR产物进行正反向测序,明确有无突变。结果一、家系及性别基因外显子基因型检测对14个家系的先证者进行3个基因5个外显子测序后,发现3个家系(图1)中的先证者携带HOKPP相关突变:CACNA1S基因的R1239H突变和SCN4A基因R672H突变。其余家系先证者未发现已知的HOKPP相关突变。进一步对这3个家系中的其他患者和相关亲属进行测序分析,结果如下。1.家系1:3代共11人,其中2例发病,为先证者及其母亲,对其母进行CACNA1S基因外显子30测序也发现存在3716G→A杂合突变,引起氨基酸序列改变R1239H(图2)。对其家系其他成员进行测序,未见此突变,提示此突变为完全外显率,男女均发病,无性别差异。2.家系2:3代共17人(获得其中15人的血液样本,Ⅱ3、Ⅱ7失访),其中3例患者均为男性,为先证者及其2位堂兄。测序发现3例患者SCN4A基因外显子12上存在2015G→A杂合突变,引起氨基酸序列改变R672H(图3)。进一步对其家系其他成员测序发现,此家系另外4人也携带此突变但未发病。其中1名男性,为先证者的弟弟,现年17岁,目前无临床症状,但不排除今后发病可能。另外3名为女性,分别是先证者的母亲、姨母、外祖母,年龄分别是38岁、47岁、73岁,既无发作性肌无力症状,也无持久性肌无力表现。提示此突变为不完全外显率,尤其是女性突变基因携带者均未发病。3.家系3:3代共15人,其中2例发病,均为男性,为先证者及其舅舅。测序发现2例患者SCN4A基因外显子12上存在2015G→A杂合突变,引起氨基酸序列改变R672H(图3)。进一步对其家系其他成员测序,发现先证者的母亲(36岁),也存在相同突变但未发病。先证者外祖父测序正常,外祖母去世,推测外祖母也携带此突变,但未发病。此家系女性突变基因携带者未发病。二、干预综合征的临床特征分析表21.血钾偏低的治疗先证者(Ⅲ2)男性,17岁,首发年龄为8岁。主要临床表现为发作性四肢力弱,严重时可累及呼吸肌,一般在夜间睡眠时出现症状,持续时间4～48h后肢体肌力恢复正常,发作恢复期出现肌肉疼痛,无肌强直。诱因有劳累、受凉、饱食、感染后、精神紧张、秋冬及冬春交界等。8岁时首次发作1次,12岁开始发作频繁,达到35～50次/年。发作期血钾偏低(1.5～2.8mmol/L)。给予补钾和乙酰唑胺治疗有效。先证者母亲(Ⅱ3)也为HOKPP患者,其临床特征见表2。2.肌强直和持久神经病先证者(Ⅲ5)为18岁男性,发病年龄为15岁。表现为发作性四肢无力,一般在晨起时发作,持续2～24h后肢体肌力可恢复正常,无肌强直和持久性肌无力表现。诱因有劳累、受凉、饱食、饥饿、感染后、情绪紧张、饮用碳酸类饮料等。发作频率:病初4～6次/年,17岁开始病情加重,100～200次/年。发作期血钾2.5～3.4mmol/L(平均2.95mmol/L)。给予补钾治疗可以减轻症状,促进恢复。给予乙酰唑胺250mg,3次/d,治疗无效。先证者的2位堂兄(Ⅲ2、Ⅲ3)也为HOKPP患者,临床特征见表2。3.发作期血钾偏低、以乙酰胺胺治疗先证者(Ⅲ4)为男性,13岁,首发年龄12岁。一般在睡眠时发病,持续时间4～12h后肢体肌力恢复正常。诱因有劳累、受凉、出汗等。发作频率:12岁发作4～5次,13岁开始发作频繁,发作达到30次。发作期血钾偏低(2.6mmol/L),尿常规、肌电图正常。补钾治疗有效,乙酰唑胺治疗无效。其舅舅(Ⅱ7)也为HOKPP患者,临床特征见表2。4.发病年龄及治疗有效CACNA1SR1239H突变携带者,男女均发病,完全外显率,发病年龄在8～9岁,乙酰唑胺治疗有效;而SCN4AR672H突变患者均为男性,女性突变基因携带者均未发病,呈不完全外显率,发病年龄在15～29岁,乙酰唑胺治疗无效。cacna1s基因s1239h突变家系的发现目前,我国HOKPP家系的研究发现有2种突变,CACNA1S基因的R528G突变和SCN4A基因R672C突变。我们对我国14个HOKPP家系先证者进行了候选基因的热点筛查,首次发现中国HOKPP家系还存在CACNA1S基因R1239H突变和SCN4A基因R672H突变。2种突变患者除具有HOKPP的典型表现外,又各具特点。CACNA1S基因R1239H突变特点为:儿童期发病,青春期加重,30岁以后病情减轻;乙酰唑胺治疗有效;完全外显率,无性别差异。SCN4A基因R672H突变特点为:青春期发病,25岁以后病情减轻;乙酰唑胺治疗无效;不完全外显率,女性突变基因携带者均未发病。因此,我们认为CACNA1S基因R1239H突变和SCN4A基因R672H突变的临床表型存在差异。通过对不同突变位点临床表型的总结,有助于今后根据临床表型推断突变位点,指导治疗,判断预后。2001年日本报道了1个CACNA1S基因R1239H突变家系,我们的研究与其不同之处在于:日本家系患者首发年龄在3～7岁,而中国患者在8～9岁;日本家系部分患者首次发病前就有持续性肌无力表现,而中国患者没有类似表现。而且,我们观察到R1239H突变家系女性患者在月经前期易发作,而妊娠期间无发作,既往的文献未见到类似报道。此现象提示女性患者的肌无力发作可能与体内的雌、孕激素水平有关。但雌、孕激素影响周期性麻痹发作的机制尚不清楚。2001年Sternberg等对58例法国HOKPP先证者进行研究发现,5例存在SCN4A基因突变(R672H3例,R672G1例,R672S1例),与我们观察到的相同之处在于乙酰唑胺对于SCN4A基因突变患者无效;不同之处在于他们观察到SCN4A基因突变在男性和女性中均为完全的外显率,而我们发现4例女性R672H突变携带者均未发病(最小的36岁,最大的73岁),1例男性R672H突变携带者也未发病(目前17岁,不排除今后发病可能,需要随诊)。因此,根据我们研究的结果,R672H突变存在不全外显率,与国外报道的不同可能是由于种族差异。文献报道HOKPP患者男性多于女性,男性约占62%,女性约占38%。HOKPP患者男性多于女性可能是由于HOKPP责任突变在女性的外显率下降。同时,某些散发的患者无家族史,也可能是由于不外显的女性基因携带者将责任突变传给子代,导致子代发病。与欧洲国家相比,亚洲各国HOKPP患者散发性多于家族性。我们发现R672H突变女性携带者均未发病,而Sternberg等观察到SCN4A基因突变(包括R672H)女性外显率为100%,我们推测可能由于种族差异,亚洲携带突变的女性外显率较欧洲人更低,造成亚洲散发性HOKPP明显多于欧洲,但尚需大样本验证。关于女性外显率低的原因,目前尚不清楚,有人提出HOKPP发病受多基因影响,并非单基因疾病。也有人提出此病可能是X-连锁隐性遗传,具体原因有待进一步研究。我们通过DNA直接测序对14个独立的HOKPP家系先证者进行了候选基因突变热点筛查,仅发现3个家系患者携带已知