渣油细菌的筛选及降解能力研究

渣油细菌的筛选及降解能力研究

据推测，世界上约有1.109吨石油及其产品通过各种方式进入地下水、地表水和土壤。随着经济的快速增长，中国的石油环境管理任务变得越来越紧迫。生物修复技术用于处理石油污染没有二次污染，处理成本低，可以完全分解污染物。作者从辽河油田渣油中经富集,分离出几十株石油降解菌,经过初筛后,选出8株降解能力强的菌株,进一步研究了其对石油不同组分的降解能力,并对降解能力强的菌株进行了初步的鉴定,以应用于石油污染的生物修复.1材料和方法1.1辽河油田渣油分离菌种油,取自辽河油田渣油,块状并混有少量泥沙.降解效果用油,辽河油田渣油及用常规石油分离方法分成的饱和烃、芳香烃、非烃和沥青质4个成分.1.2培养基1.2.1培养基的制备牛肉膏蛋白胨培养基;2倍稀释牛肉膏蛋白胨培养基;10倍稀释牛肉膏蛋白胨培养基,原油量为3g/L;无机盐培养基(g/L):K2HPO4·3H2O1,KH2PO41,MgSO4·7H2O0.5,NH4NO31,CaCl20.02,FeCl3痕量,原油3,pH值7.2～7.4.1.2.2表面保存培养基1.2.3液体培养基g.l1.3牛肉膏蛋白的纯化无机盐培养基中加1%(w/v)原油样品,30℃摇床培养7d,取富集液2mL接种相同新鲜培养基,相同条件下培养7d,如此连续富集培养30d,以牛肉膏蛋白胨培养基平板进行分离纯化,纯化后的菌株保存于牛肉膏蛋白胨斜面.1.4脱脂棉过滤菌液降解将活化的斜面培养物接至装有30mL液体培养基的100mL三角瓶中培养,摇瓶转速180r/min,温度30℃.培养7d后,以在氯仿中预先处理过的脱脂棉过滤菌液,蒸馏水多次洗涤,脱脂棉60℃干燥,用氯仿对原油重新回收,自然干燥后称取残重,每一处理重复3次计算平均降解率.1.5原油不同成分的降压试验将活化的斜面培养物接至装有30mL液体培养基的100mL三角瓶中培养30d,摇瓶转速180r/min,温度30℃.残油的回收同上.1.6rtorusb211dd的量表降解率用降解前后油的失重表示,采用sartoriusBP211Dd=0.01mg的分析天平定量;采用色谱法和质谱法对各单组分油降解前后的组成进行分析.1.7识别菌株和其他疾病根据细菌分类手册的标准,对分离到的部分菌株进行了初步的形态观察和生理生化试验,初步鉴定到属.2结果与分析2.1病毒固产分析的结果经富集分离共得到24株细菌(编号ptr1～ptr24)和几株真菌,均具有一定的石油降解能力.2.2降解率的比较及ptr1、ptr5和ptr5的降解情况以原油为唯一碳源接种,对所分离的菌株进行降解能力的初步研究,对照为不接菌的石油培养液,降解效果见表1.由表1可见,经7d降解后不同菌对原油的降解率明显不同,对照降解率为4.6%,菌株降解率最高可达到41%,而最低只有7.3%,共有10株菌的降解率达到30%以上,结合降解过程中的现象观察,选取ptr1、ptr4、ptr5、ptr10、ptr13、ptr14、ptr15和ptr20菌株作进一步的研究.2.3沥青质、ptr15对芳香烃的降解率不同的石油降解菌对于石油中不同的烃类具有不同的降解能力,据报道,多数石油降解菌只能利用一种或几种烃类.石油烃中的中长链饱和烃易于被微生物利用,而短链烷烃和芳烃等难于降解,甚至对微生物具有一定的毒性.作者研究了所筛选的8株菌对原油的不同组分,饱和烃、芳香烃、非烃和沥青质的降解效果,结果见表2.由表2可见,原油不同组分可被降解的程度不同,芳香烃的降解率较高,可达80%;沥青质的最大降解率为53%;饱和烃的最大降解率为37%;非烃的最大降解率为30%.不同菌对各组分的降解能力也不同.ptr15对饱和烃和非烃的降解率最高,分别为37%和30%;ptr13对芳香烃的降解率最高,为80%;ptr20对芳香烃的降解率为69%;ptr10和ptr20对沥青质的降解率均为53%,ptr5降解率为50%.由表2还可看出,所筛选的菌株都对芳香烃和沥青质具有高的降解率,这与芳香烃和沥青质在结构上的相似性是吻合的.PotterThomasL等人对CerroNegro的沥青质降解试验发现,在37℃,添加碳氮源的情况下好氧培养60d,沥青质的最高降解率为40%,而作者所筛菌株对沥青质的降解率比其提高13%,且降解时间由60d缩短一半,具有良好的应用前景.2.4在石油中不同成分的骨折前后分析综合考虑了芳香烃和饱和烃的降解结果,选取饱和烃和芳香烃降解程度都比较高的ptr15和ptr20的降解产物作色谱分析.2.4.1gc-ms分析对饱和烃进行色谱分析发现,未经降解的对照样品中缺失正构烷烃系列,而甾烷和萜烷丰度较高,表明所用样品已在自然条件下被部分降解,增加了进一步降解的难度.降解后,短链烷烃峰消失,表明所用菌株都对短链烷烃具有强的降解能力,但是,从色谱图上无法分辨各菌株降解能力的差异,故进行了GC-MS图谱分析.图1是菌株ptr15和ptr20的M/z82的GC-MS图谱.由图1可见,与对照相比,烷基环己烷发生明显降解,ptr20的降解能力优于ptr15.结合M/z92、M/z123质量色谱图变化规律表明,烷基环己烷、长链烷基苯和二环烷系列都能有效被微生物降解,且ptr20的降解能力要高于ptr15,这与总离子流图所反映的变化相吻合.2.4.2菲、甲基菲的降解图2是菌株ptr15和ptr20的M/z178、M/z192的GC-MS图谱,即三环的菲和蒽以及甲基菲的碎片特征离子,M/Z192即M/Z(178+14)(1个甲基-1个氢原子),将2种离子放在一起,主要是为了查看菲与甲基菲的分布特征.从芳烃总离子流图上看(图未列出),降解前芳烃的组成以轻质组分为主,ptr15或ptr20菌降解后轻质组分均缺失.并且在总离子流图上较后的位置出现了明显的“鼓包(UCM)”降解前后m/z128、m/z142、m/z156和m/z170质量色谱图分布特征表明(图未列出),原始样品中含有完整的萘、甲基萘和C2、C3取代的萘系列,但降解后样品中只残存极微量的萘,烷基萘系列几乎消耗殆尽.对比降解前后m/z178、m/z192和m/z252质量色谱图特征发现,所选菌株对三环的菲和甲基菲以及五环的苯并芘在现有降解条件下降解作用不明显.不同菌株对芳烃中不同组分的降解能力无明显差异.2.5菌株鉴定结果根据降解能力及降解过程中的现象观察结果,对所筛选的8株菌中的5株进行了菌体形态特征及生理生化试验,结果见表3.根据常用细菌鉴定方法,初步确定ptr10为假单胞菌属,ptr13为棒状杆菌属,ptr14为假单胞菌属,ptr15为芽孢杆菌属,ptr20为微杆菌属.3不同成分的芳香烃降解石油是由上千种化学性质不同的化合物组成的复杂混合物,主要由烃类和非烃类组成,其中烃类占95%～99.5%.烃类主要有烷烃、芳香烃、环烷烃、稠环和杂环化合物,还有少量沥青质和其他有机物.不同微生物对石油各组分的降解率是不同的,其中饱和烃的降解率最高,其次是低分子量的芳香烃类化合物,而高分子量的芳香烃类化合物、树脂和沥青质则极难降解.石油组成成分的差异也影响其生物降解率.低硫、高饱和烃的粗油最易降解,高硫、高芳香烃类化合物的纯油最难降解,所以目前对烃类化合物降解的研究主要集中在毒性较强的芳香族化合物.除饱和烃的降解不符合此规律外,芳香烃的降解率最高,可达80%;其次是沥青质;而非烃的降解率最低,只有30%.饱和烃的降解速率最快,48h已经部分乳化,推测降解产物可能是一些小分子的、非水溶性短链烃.通过GC-MS图谱分析发现,样品已在自然条件下被部分降解,而烷基环己烷、长链烷基苯和二环烷系列能有效被微生物降解,这与推测基本相符.4芽孢杆菌属bacl4.1分离筛选出8株降解能力强的菌株,对其中的部分菌株初步鉴定到属,分别属于假单胞菌属(Pseudomonas);棒状杆菌属(Corynebacterium);芽孢杆菌属(Bacillus);微杆菌属(Corynebacterium).4.2石油中不同组分可被微生物降解的