纳米颗粒在生物医学中的应用

纳米颗粒在生物医学中的应用

纳米技术是多学科齐聚一堂21.10纳米的纳米技术的前沿技术。1959年,美国物理学家Richard首次提出了在纳米空间操纵物质的概念。Drexler将纳米技术定义为“分子制造的产品和过程,即操纵分子并进行分子装配所形成的产物及其控制过程”。纳米生物技术是用于研究生命现象的纳米技术,是纳米技术和生物技术的结合,它是在分子水平上,结合物理,化学和遗传规律对生物材料进行加工,其最终目的是组装成一系列高度功能化的体系,包括:纳米生物传感器,纳米成像,纳米生物芯片,纳米生物相容性人工器官,药物和基因转运纳米载体等,这些研究多以早期诊断疾病,提高临床疗效和改良生物品种为目标。另一方面,医学和生物技术在疾病诊断与治疗方面的进展依赖于对生化过程的深入理解。疾病的诊断追踪到分子水平的异常,称为分子诊断,并可以根据该异常来制定针对单个病人的个性化治疗方案。分子诊断技术除应用于临床诊断外,在生物研究、生化武器的检测,新药研发和治疗新方法的评估,如基因治疗和RNA干扰等方面的地位也十分关键。虽然如今已存在众多用于疾病诊断和治疗的方法,但是采用接近分子水平的研究工具,如纳米颗粒,纳米探针或其他一些纳米材料,将会更好地理解和揭示疾病的发生发展机制。与微加工技术革命化电子工业一样,纳米技术也正为包括基础研究、疾病诊断和治疗在内的生物医学领域的发展带来新的契机。本文将评述目前国际上以纳米颗粒(nanoparticles,NPs)为基础的纳米技术在生物传感器及生物检测中的最新应用及发展前景。1纳米材料的构成纳米颗粒通常大于1nm,是生物医学领域应用最广的纳米材料,也是目前研究得最多的纳米材料之一。实现对纳米颗粒的尺寸大小、粒度分布、形状、表面修饰的控制,以及它们光电化学中的应用,是纳米颗粒研究的关键。这种介于微观与宏观之间的一类新的物质层次,出现了许多独特的性质。(1)纳米颗粒及纳米颗粒的光学性质随着颗粒尺寸的变小,在一定条件下会引起颗粒性质的变化。由于颗粒尺寸变小引起的宏观物理性质的变化称为小尺寸效应。对纳米颗粒而言,尺寸变小的同时,其比表面积亦显著地增加,表面原子的电子能级离散、能隙变宽,晶格改变,表面原子密度减小,从而产生一系列新的性质:特殊的光学性质——所有的金属在超微颗粒状态都呈黑色,尺寸越小,颜色越黑,对光的反射率可低于1%;特殊的热学性质——超细颗粒的熔点显著降低,当颗粒小于10纳米量级时尤为明显。(2)逐渐颗粒尺寸的变化介于原子、分子与大块固体之间的纳米颗粒,将大块材料中连续的能带分裂成分立的能级,能级间的间距随颗粒尺寸减小而增大。当热能、电场能或磁能比平均的能级间距还小时,就会呈现一系列与宏观物质截然不同的反常特性。(3)球形颗粒表面化学活性与表面积的关系纳米粒子表面原子数与总原子数之比随粒径的变小而急剧增大后所引起的性质上的变化。球形颗粒的表面积与直径的平方成正比,其体积与直径的立方成正比,故其表面积/体积之比(即比表面积)与直径成反比。随着球形颗粒直径变小,其比表面积将会显著增大,使之具有很高的表面化学活性。表面效应主要表现为熔点降低,比热增大等。(4)粒子发生隧道效应是基本的量子现象之一,即当微观粒子的总能量小于势垒高度时,该粒子仍能穿越这势垒。近年来,人们发现一些宏观量如微颗粒的磁化强度、量子相干器件中的磁通量及电荷等也具有隧道效应,它们可以穿越宏观系统的势垒而产生变化,故称之为宏观的量子隧道效应。(5)界面状态的造成由于纳米颗粒体积极小,所包含的原子数很少,因此,许多与界面状态有关的诸如吸附、催化、扩散、烧结等物理、化学性质将与大颗粒传统材料的特性显著不同,就不能用通常有无限个原子的块状物质的性质加以说明。2银/金核-壳探针的制备方法除了纳米颗粒的特性,其组成成分对于他们的适用性也是非常重要的,如成分决定了纳米探针与被分析物的兼容性和匹配性,也决定了检测精度能达到什么级别。最常见用来制备纳米颗粒的原材料是金,硅和半导体(如CdSe,ZnS,CdS)等。金对于纳米生物技术来讲是一种活性材料,因为金纳米颗粒能与巯基之间发生强的共价键合,这使得胶态金与巯基标记的生物活性分子可结合形成的探针,用于生物体系的检测中。Frens较早用柠檬酸三钠还原HAuCl4得到纳米级胶体金颗粒。据此,研究者进一步优化此方法合成了直径在13nm左右的纳米金。纳米金较容易被改良,因为它具有微弱的带电配体的结合层,能保持稳定;而CdSe和CdS量子团则很难被改良,因为它们的活性表面容易被结合也难以被取代。改良纳米金的方法现在已经最优化,适合于大范围的粒径及多种表面组分。借用纳米金表面易被修饰的特性,Mirkin提出了一种合成金壳银核的核-壳型纳米颗粒的方法,该方法中,薄金壳包裹在银纳米粒子表面,形成一种金外包被的颗粒,它易于被烷基修饰的寡核苷酸共价结合,从而形成新型的银/金核-壳探针。该纳米颗粒即保持银的化学和物理特性,又具有金的稳定性;这种新型纳米探针与纯金体系的探针有完全不同的色度改变,所以二者可用来检测同一样本中两种不同的目标DNA。硅是一种在生物分析中被广泛采用的材料,如生物传感器,生物芯片等。它可以通过多种加工技术合成,用来制备纳米颗粒、透明薄膜以及固体平面材料。硅纳米颗粒的制备有两种经典的途径,一种是倒转微乳化法,主要是用来合成染料掺杂硅颗粒和超小磁性硅颗粒;另一种是Stöber方法,用于制备纯硅颗粒和有机染料掺杂硅颗粒(见图1)。所合成硅颗粒的特征是通过尺度、光学或者磁学特性来描述的。可用透射电镜或扫描电镜来确定纯硅颗粒的粒径,一般直径在60～100nm之间。染料掺杂硅颗粒中的染料分子可以是双吡啶钌(RuBpy-)、若丹明、四甲基右旋糖苷以及荧光素右旋糖苷等,这种硅颗粒的大小和光学特性是决定其用途的最主要因素。磁性硅颗粒包括Fe3O4/SiO2和Fe2O3/SiO2两种,其直径大约在2～3nm;用超导量子干扰装置(superconductingquantuminterferencedevice,SQUID)来分析其粉末形式,发现磁性硅颗粒的特性接近超顺磁性物质,可见大小和磁学特性将决定磁性硅颗粒的最佳合成条件。量子点(quantumdots,QNs)是一种半导体晶体材料的纳米颗粒,直径在10nm以内,较普通细胞的体积小数千倍,具有吸收波长范围宽和发射波长范围窄的特性,不同材料的量子点还会发出不同的荧光。用做量子点的材料有硒化镉(CdSe)、硫化锌(ZnS)、砷化铟(InAs)等,在近几年的研究中硒化镉最受重视。量子点的合成途径有多种,从传统荧光标记的量子点到用作测量各向异性的拉长“纳米杆”;较经典的是“由下向上”的一步法反应,即同一容器中,无机物的化学转化与纳米结晶过程。最初使用的量子点小于10nm,比金属及磁性纳米颗粒的表面积更小,其发光效率也低,还容易发生光化学降解和聚集。CdSe/ZnS是化学合成的无机物,为了增加其胶体稳定性、水溶性和减少非特异性吸附及细胞内聚集,并减少被网状内皮系统的吞噬,常对其进行亲水性处理:一种是用表面活性剂,如二氢硫辛酸、巯基乙酸等处理其表面,或用聚乙二醇PEG修饰包被的聚合物;另一种是在其表面包被蛋白质,如卵白素、生物素、链亲和素等,这样使其表面获得亲有机物的巯基、羧基等活性基团,以结合蛋白质、抗体、肽或核酸。另外,由于CdSe与ZnS以静电结合而成,表面带负电荷,可结合带中性电荷或阳性电荷的蛋白质及抗体(如IgG等)。3纳米生物传感器纳米材料本身就是非常敏感的化学和生物传感器,固定有能选择性结合靶分子的生物探针的纳米传感器称为纳米生物传感器。它们能和生物芯片等技术结合,从而使分子检测更加高效、简便。纳米生物传感器在微生物检测,体液代谢物监测以及组织病变,例如肿瘤的早期发现等方面应用较多。3.1硅纳米线实时监测由于纳米颗粒表面易于改良,纳米线实际上可以被任何可能的化学或生物识别分子所修饰。纳米材料以一种极度敏感,实时和定量的方式将发生在它表面的化学键合事件转换成纳米线的电导率。掺硼的硅纳米线已经被用来制作高度敏感,实时监测的传感器,用于检测pH值以及pM浓度的抗生物素蛋白、Ca2+等生化物质(见图2),今后还可以发展应用到阵列扫描和在体诊断中。研究能快速、直接地分析小分子物质和蛋白质大分子特异性结合的微型仪器,对于发现和筛选新药分子有实质性的意义,Wang等报导了一种硅纳米线场效应晶体管(FET)装置,在酪氨酸蛋白激酶(Abl)的介导下,它能高度敏感,免标记地直接检测到ATP以及ATP的小分子阻断剂(Gleevec),因此能成为药物开发的一项技术平台(见图3)。3.2免疫组织化学病毒颗粒实际上就是生物纳米颗粒。单纯疱疹病毒(HSV)和腺病毒可以触发磁性纳米珠的集合,从而成为临床上检测相关病毒的纳米传感器。纳米珠由超磁性氧化铁内核包被右旋糖苷组成,再附着作为抗病毒抗体的G蛋白。在Weissleder小组的试验中,经磁场作用,一个10mL的血清样本中能检测到少至五个的病毒颗粒。该系统要比酶联免疫吸附试验(ELISA)敏感,同时也比基于PCR扩增的检测方法有所改进(见图4)。但是利用纳米线场效应晶体管,Hayden能直接、实时地从样本中检测到单个流行性感冒病毒A颗粒(见图5);而且用两种抗体修饰的纳米线装置能平行检测出相应的流行性感冒病毒和腺病毒,这提示如果这种装置具有大规模区分能力的话,就有可能在单个病毒水平上同时检测到多种不同的病毒侵袭。3.3spr光谱检测技术表面等离子体共振(SPR)是一种光和金属电子相互作用的光-电子现象,它是将光子所携带的能量转移给金属表面的电子。如今,迫切需要能特异鉴别周围环境中低浓度生物物质的微型化光学传感器,但目前还不存在未经扩增就能鉴定出自然浓度的这种仪器。借助局部SPR光谱技术,可利用三面体银纳米颗粒制成一种新型的光学传感器,因为这种银颗粒具有显著的光学特性,且能大大提高检测的敏感性(见图6)。该SPR纳米生物传感器为只需用简单、轻便、经济的仪器来实现超敏感的生物检测提供了一条有效途径。结合纳米技术、生物学和光子学,Vo-DinhT等提出了一种激光纳米传感器,用来对单个活细胞中的蛋白或生物标记进行胞内分析。这种纳米传感器的光纤被拉长至尖端达到纳米级范围,并被生物探针(如抗体或酶底物)修饰;将尖端插入细胞,激光导入光纤后,尖端的消散区则会激发目标分子与探针结合,光度检测系统采集结合区域的光信号(如荧光)后用于分析。利用这种激光纳米传感器,Vo-DinhT等相继报导了在单个活MCF-7细胞(人乳腺癌细胞株细胞)中检测Caspase-9蛋白(见图7)和细胞色素C蛋白活性的实验。3.4靶向分子检测肿瘤中的分子肿瘤生物传感器由量子点与能够识别肿瘤细胞标志物的特异性靶向分子,如特异性配体、单克隆抗体、核酸探针等组装而成,通过靶向分子与肿瘤细胞表面标志物分子结合,利用物理方法来测量传感器中的磁信号、光信号等,可实现肿瘤的定位和显象,有利于肿瘤的早期诊断。4纳米技术在生物检测中的典型应用4.1荧光标记法检测dna微阵列生物芯片是在很小几何尺度的表面积上,装配一种和集成多种生物活性分子,仅用微量生理或生物采样,即可以同时检测和研究不同的生物细胞、生物分子和DNA的特性,以及它们之间的相互作用,获得生命微观活动的规律。传统的生物芯片有不少局限性,如不能很好地固定DNA、样品的需要量大、荧光标记不可直接读出和敏感度低等。将纳米技术应用到生物芯片上后,将极大改善这些局限性,它可采用自组装的方法来固定;样本需要量少但敏感性能大大提高;结合微电子技术,高产而成本低。在过去的二十年中,DNA序列的检测在遗传学,病理学,刑事学,食品安全等方面越来越普遍和重要,因此向研究者提出更高的要求,需在同一样本中同时进行千百万不同DNA序列的检测,于是DNA微阵列,也称基因芯片应运而生。但是,目前的DNA微阵列还面临不少困难:如阵列的制作和读出都必须微型化,以满足“芯片上的实验室”的需要;阵列需有高选择性和高灵敏度。基于荧光标记的检测体系近年来在DNA芯片中的重要作用已经获得认同,并且在基因差异表达、基因突变、基因多态性研究和基因诊断等领域得到了应用,但其寡核苷酸阵列的制作以及后续的杂交检测都有较高的仪器设备要求,荧光标记物也比较昂贵,这是一般实验室条件无法达到的。因此,建立和发展高效、快速、低成本的DNA序列测定新方法显得尤为重要。纳米颗粒的DNA阵列技术改善了荧光标记阵列的局限性,是一种新的可望广泛应用的DNA检测方法。在任何异源DNA微阵列的检测中,目标DNA链均需要被标记,以便信号的观察,标记目标DNA的方法见图8。除了纳米金用于DNA检测和DNA微阵列外,RuBpy-硅颗粒也能用于痕量DNA检测,该试验基于“三文治”机制(见图8(c)),能检测pmol浓度以下的靶序列。量子点本身就是荧光标记物,与生物大分子共价结合后,也能实现超敏感的生物检测。然而,配位键的性质能显著影响量子点的光物理特性,所以限制了它在这方面的应用。微小RNA(miRNAs)是一种高度进化保守的小的未编码RNAs,在动植物细胞内发挥着重要的调节作用,它能剪切mRNAs或是抑制其转录。MiRNAs的错误调节会导致多种人类疾病,探明miRNAs的表达情况对于研究miRNAs的生物功能十分重要。大多数的研究小组采用的是Northern杂交和miRNA克隆的方法来分析,Ruan报导了一种新型的miRNA微阵列,在试验中,目标miRNA的3’末端先被生物素标记,然后与固定在玻片上的互补寡核苷酸-DNA进行杂交,再加入抗生物素修饰的量子点,最后检测结合在miRNA上的量子点的荧光强度;也可以加入纳米金探针,经银沉淀加强后检测(见图9)。相比Northern杂交等方法,该途径增强了检测效率,同时灵敏度也大大提高。4.2抗体修饰纳米颗粒检测快速、灵敏地检测出致病菌对于食品安全,临床诊断和治疗以及反生物恐怖等方面十分重要。铁磁纳米粒和陶瓷纳米球已经应用于这些方面,但是并不能令人满意。Tan等提出了一项新的生物纳米技术,该技术是采用生物修饰的纳米颗粒,通过荧光信号为基础的免疫试验,快速、准确地检测出单个细菌。他们选择的是大肠杆菌O157:H7作为检测细菌,因为它是食物来源肠道感染致病菌的最主要代表。传统检测微量细菌的方法需要扩增或是富及样本中的目标菌,因过程繁琐而费时费力。该研究中,纳米颗粒起到极强的信号放大作用,细菌众多的表面抗原可供抗体修饰的纳米颗粒识别与结合,所以每一个细菌表面将结合数以千计的纳米颗粒,从而提供极强的荧光信号(见图10)。该方法甚至能发展到384孔微平板的多菌样本高通量检测。因此,用针对不同细菌的特异性抗体来修饰纳米颗粒,这项纳米生物技术就能用来检测多种来源的细菌病原体,包括生物恐怖试剂以及食品、临床和环境样本。至于病毒检测,在纳米传感器中已经叙述过。近年来,我们课题组进行了交流阻抗谱免疫传感器检测大肠杆菌O157:H7的实验研究,以期建立电化学阻抗谱和免疫传感器联用技术的检测系统来快速、准确地检测致病微生物。根据电化学阻抗谱良好的界面表征特性,采用硅烷化单分子层的固定化技术,将抗体固定在三氧化二