抗苗勒管激素与抗苗勒管激素对小鼠颗粒细胞上卵刺激素受体mrna表达的影响

抗苗勒管激素与抗苗勒管激素对小鼠颗粒细胞上卵刺激素受体mrna表达的影响

由于卵巢衰竭，女性的更年期发育导致闭经、卵巢萎缩、卵巢刺激素增多和雌激素水平下降。这是一种严重影响女性身心健康的卵巢功能低下疾病。临床表现见不同程度的潮热多汗、阴道干涩、性欲下降等绝经前后症状,并且导致患者骨质疏松、心血管疾病等绝经后疾病提前发生,该病发病率占成年女性的1%~3%,发病机制尚不清楚。近年来卵巢局部调控因子成为研究的热点,抗苗勒管激素(anti-Mullerianhormone,AMH)是重要的卵巢局部调控因子之一,AMH与颗粒细胞上卵泡刺激素受体(follicle-stimulatinghormonereceptor,FSHR)的关系成为关注的问题。2010年10月至2011年6月本实验通过体外分离培养小鼠原代颗粒细胞,加入不同浓度的AMH于培养液中,观察各组间颗粒细胞上FSHRmRNA的表达情况。报告如下。1材料和方法1.1小鼠和小鼠抗小鼠抗体孕马血清促性腺激素(宁波第二激素厂),DMEM/F12培养基(美国HyClone公司),无支原体胎牛血清(杭州四季青生物材料工程有限公司),胰蛋白酶、乙二胺四乙酸、青霉素、链霉素(美国Sigma公司),FHSR山羊抗小鼠抗体(SantaCruzBiotechnology),荧光PE标记二抗,Trizol,5×逆转录buffer,5×SYBRGreenⅠPCRbuffer,dNTPs,MMLV,Taq酶;CO2培养箱(日本SANYO),低温高速离心机(德国Eppendorf公司)体视显微镜(德国Leica公司),普通光学倒置显微镜(日本OLYMPUS),ABI3900台式高通量DNA合成仪,ABI9700PCR仪,ABI7500全自动荧光定量PCR仪。1.2实验动物5~7周的SPF级昆明雌性小鼠,体重18~22g,由广东省医学实验动物中心提供。1.3方法1.3.1组织病理学观察选15只5~7周的昆明雌性小鼠,每只小鼠注射15~20单位的孕马血清促性腺激素,48~54h后颈椎脱臼法处死。处死后的小鼠放入75%的酒精中浸泡1~2min后,解剖取双侧卵巢,把卵巢立即放入预冷的无菌PBS中,用无菌PBS冲洗3遍,在解剖显微镜下剔除卵巢上的包膜、脂肪组织,再用PBS洗2~3遍,在解剖显微镜下用1号针头刺破卵泡,释放颗粒细胞。把卵巢组织和混有颗粒细胞的PBS液放入离心管中,1000r/min离心5min后弃上清液,用含0.25%胰酶-0.02%的乙二胺四乙酸悬浮细胞,放入培养皿中,加含0.25%胰酶-0.02%的乙二胺四乙酸到4mL,用吸管轻轻吹打分散细胞,放入37℃、5%CO2培养箱中消化30min,期间吹打2~3次。消化完毕后用含胎牛血清的全培养基终止消化,1000r/min离心5min,弃上清液,用全培养基(85mLDMEM/F12+15mL胎牛血清+1mL青-链霉素)悬浮,制备成单细胞悬液。将细胞稀释成1×106·mL-1的细胞悬液,接种于6孔板中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养,36~48h后第1次换液,以后隔天换一次培养基。1.3.2小鼠细胞抗能力检测(1)形态学观察:在倒置显微镜下观察细胞的形态学特征并拍照;(2)FSHR表达鉴定颗粒细胞的纯度:取生长旺盛的第4天的细胞,倒掉培养基,用无菌PBS洗3遍,用含0.25%胰酶-0.02%的乙二胺四乙酸消化5~10min,光学显微镜下观察细胞的变化,待大部分细胞变圆形后立即加入含胎牛血清的全培养基终止消化,1000r/min离心5min后弃上清液,加入PBS制成1×106·mL-1的细胞悬液,分成两管,实验管中加入FSHR山羊抗小鼠抗体和二抗羊抗鼠IgG-FITC,对照组只加二抗,室温下孵育30min,上机检测;(3)免疫荧光鉴定颗粒细胞:细胞爬片后,用4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮),PBS漂洗2次,5min/次,然后用1%BSA封闭30min,再加入1%BSA稀释的一抗FSHR山羊抗小鼠抗体(1∶200),于37℃杂交2h后,PBS漂洗2次,5min/次,加入1%BSA稀释的二抗IgG-PE,于37℃杂交1h,PBS漂洗2次,5min/次,最后用5μg/mLDAPI染色2min,用抗淬灭封片剂封片,于荧光显微镜下观察并拍照。1.3.3加入不同浓度的amh,并以推动各施细胞的表达为前提将细胞制成1×106·mL-1的细胞悬液,接种于6孔板中,每孔种2mL,培养24h后换液,并加入不同浓度的AMH,分组如下:(1)空白对照组;(2)AMH5ng/mL组;(3)AMH10ng/mL组;(4)AMH20ng/mL组;(5)AMH30ng/mL组;(6)AMH40ng/mL组。每组重复3个平行孔。继续培养72h后,取出后做荧光定量PCR的检测。1.3.4rna的纯化、鉴定与引物的合成(1)总RNA的提取:将已加入Trizol的细胞液充分振荡混匀,加入氯仿0.2mL,盖紧盖子,用力摇动15s,15~30℃孵育2~3min,4℃12000r/min离心15min,取上清液至新的1.5mLEppendorf管,加与上清液等体积的异丙醇,15~30℃孵育样品10min,4℃12000r/min离心10min,弃上清液,75%乙醇(含DEPC水)洗涤沉淀1次(至少1mL75%乙醇/mLTrizol),4℃7500r/min离心5min,弃乙醇,空气或真空干燥5~10min(不要完全干燥),加DEPC处理水溶解RNA,-80℃保存备用。取一部分样品静紫外分光光度计测RNA的纯度,测定OD260/280>1.8,表明纯度合格。取部分样品进行电泳分析,测定RNA是否降解;(2)引物的设计与合成:GenBank上查找目的基因mRNA序列,在CDS区设计特异性引物,用Primerexpress2.0软件设计引物,ABI3900台式高通量DNA合成仪合成引物。FSHRmRNA引物(序列号NM013523),上游引物:5′-ATCCACATCATTGCCAGGAACTC-3′,下游引物:5′-GGTTCCGTTGAATGCACAGTTG-3′;内参GAPDH引物(序列号NM008084),上游引物:5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′,下游引物:5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′;(3)逆转录反应:取4μLRNA模板做逆转录反应,仪器为ABI9700仪(美国ABI公司),反应体系含如下成分:5×逆转录buffer、引物、dNTPs(10mmol/L)、MMLV(200U/μL)、DEPC水、RNA模板,反应总体积20μL,反应条件为37℃1h,然后95℃3min;(4)待测样本反应体系:5×SYBRGreenⅠ、PCRbuffer、上下游引物(10pmol/μL)、dNTPs(10mmol/L)、Taq酶(3U/μL)、cDNA,反应总体积50μL,反应条件为:93℃3min,然后93℃30s,55℃45s,72℃45s,共40循环。1.4统计方法应用SPSS13.0统计软件,计量资料组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。2结果2.1细胞贴壁生长刚种入培养瓶中的细胞呈圆形或椭圆形,颗粒细胞单层贴壁生长,贴壁后的颗粒细胞形态完整,呈梭形或多角形。24h后细胞开始贴壁生长(图1-A);48h见细胞贴壁良好,并有明显的增殖,生长旺盛(图1-B);72h后细胞生长极度旺盛(图1-C)。2.2胞胞浆检测结果FSHR由卵巢颗粒细胞特异性表达于细胞胞浆,细胞检测的结果见图2,共检测了10000个细胞,表达FSHR的细胞共8383个,占83.83%。2.3红苏叶红松林红酵母染色FSHR为卵巢颗粒细胞的特异性表达受体,FSHR阳性染色定位于胞浆,红色荧光为FSHR阳性表达(图3-A),蓝色荧光为DAPI染色的细胞核(图3-B),图3-C为FSHR和细胞核染色共显图。2.4pcr中的荧光定量结果2.4.1凝胶成像仪电泳每组分别跑3个泳道,进行2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪记录电泳结果。如图4,可清晰见到28S、18S条带,5S条带亦可见到,说明RNA未降解,可以进行后续实验。2.4.2amh对fshrna表达的影响浓度5和10ng/mL组FSHRmRNA表达量显著高于对照组(P<0.05),其他组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),但随着AMH浓度提高FSHRmRNA表达呈下降趋势,见表1。说明AMH与FSHRmRNA的表达存在一定的拮抗关系。3amh在卵巢发育中的表达卵巢功能调节除了传统的内分泌轴调节外,以卵巢旁分泌调节是重要的调节途径之一。卵巢颗粒细胞能够产生多种卵巢局部调控因子,并能促进卵泡的生长、卵母细胞成熟,在卵泡的发育中起着重要的作用。而作为转化生长因子β(TGF-β)超家族成员之一的AMH是重要的卵巢局部调控因子之一,其主要由窦前卵泡和小窦卵泡(直径≤4mm)的颗粒细胞分泌,能够抑制卵泡的起始募集,阻止卵泡由静止阶段进入生长阶段,另外一个重要的作用是能够降低生长卵泡对FSH的敏感性。FSH是由垂体分泌的一种糖蛋白激素,主要作用是促进颗粒细胞增生分化,并通过与卵泡表面的FSHR结合从而发挥调节卵泡作用,而AMH能够拮抗FSH对卵泡生长的促进作用。有报道提示AMH通过抑制FSH依赖的芳香化酶活性从而降低FSH敏感性,AMH与FSH的这种关系是否亦通过调节卵巢颗粒细胞上的FSHR来实现,对进一步阐明AMH作用机制以及指导临床用药具有重要价值。AMH是分子量为140kD的二聚体糖蛋白,与抑制素(inhibins)、活化素(activins)、骨形态形成蛋白(BMPs)、生长分化因子(GDFS)等共同构成TGF-β超家族,与TGF-β家族其他成员的广泛表达不同,AMH的表达仅限于性腺,参与卵泡生长发育。人类卵巢中AMH于妊娠36周开始表达,这个时间苗勒氏管已经对AMH失去敏感性。青春期后AMH血清浓度达到高峰,并持续整个生育年龄,然而在女性整个生育年龄,其浓度较低,绝经后检测不到。在雌性小鼠,AMH于出生后开始表达于生长卵泡的颗粒细胞中,始基卵泡的前颗粒细胞不表达,当始基卵泡募集进入生长池,颗粒细胞开始表达AMH,在次级卵泡、窦前卵泡和≤4mm的小窦状卵泡中表达较高,而在大的窦前卵泡和小的窦状卵泡(直径≤4mm)中表达水平最高,主要由卵丘颗粒细胞而非壁颗粒细胞产生,在直径4~8mm的窦状卵泡中则几乎无AMH表达。研究表明,AMH在窦状卵泡之后的阶段以及闭锁卵泡、膜细胞、卵母细胞和卵巢间质细胞中均不表达。由于AMH与整个卵泡的生长发育过程密切相关,因此被很多研究认为是反映卵巢储备的最佳指标,学者们也进行了各种临床或动物实验研究探讨AMH在卵巢相关疾病如多囊卵巢综合征(PCOS)和POF中所扮演的角色,以求进一步揭示此类卵巢相关疾病的病因或探讨AMH在临床应用中的价值。事实上,大部分PCOS或POF患者的病因目前尚不清楚。以POF为例,据SHELLING报道,35%POF患者是由于自身免疫、家族遗传或者X染色体异常引起,而高达65%的该病患者是病因未明的,目前认为卵巢早衰发生的可能机制与卵巢内始基卵泡形成数目的减少、已形成的卵泡闭锁速度加快时卵巢过早失去卵泡池有关;同时,卵泡细胞膜上FSH受体减少或功能异常对FSH的刺激不敏感而致卵泡停止生长。而KALU等的研究显示1%~3%女性受到POF困扰,因此揭示POF病因对于临床实践无疑具有重要意义。已有研究提示,AMH通过抑制FSH依赖的芳香化酶活性,降低卵泡对FSH的敏感性,从而抑制卵泡的生长。而FSH发挥卵泡调节作用与其受体FSHR密不可分,因此本实验试图探讨AMH是否亦通过影响FSHR而抑制FSH的敏感性。我们的研究结果显示,通过测定在不同浓度的AMH培养基中颗粒细胞上FSHRmRNA表达,发现当AMH浓度为5ng/mL时,颗粒细胞上FSHRmRNA的表达量最高,AMH浓度逐渐增高时,FSHRmRNA的表达则逐渐降低,提示AMH的浓度与FSHRmRNA的表达具有负相关趋势,说明AMH与FSH的拮抗关系与AMH拮抗颗粒细胞上FSHRmRNA的表达有关。POF患者血清中FSH值升高,但卵巢中几乎没有卵泡发育,表明卵巢早