复元醒脑汤对糖尿病脑梗塞大鼠胰岛素抵抗的干预作用

复元醒脑汤对糖尿病脑梗塞大鼠胰岛素抵抗的干预作用

脑梗死是老年人的常见疾病。由于脑动脉粥样硬化,使脑动脉管腔狭窄,血管内膜损伤,进而因多种因素使局部血栓形成,加重动脉狭窄或使脑动脉完全闭塞,导致脑组织缺血、缺氧、坏死,进而引起各种神经功能障碍的一种脑血管病。脑梗塞同时也是糖尿病的慢性并发症之一。据统计,糖尿病性脑血管病变的发生率是非糖尿病患者的3倍以上。国内外许多研究认为,老年人群胰岛素抵抗(InsulinResistance,IR)的发生率升高,胰岛素抵抗是导致脑梗塞发生的危险因素,在老年缺血性脑血管病的发病中是最重要的诱因之一,并可能是一个独立的危险因素,脑动脉硬化程度与胰岛素抵抗程度有正相关的平行关系。胰岛素抵抗会导致不同程度的脂质代谢紊乱、血液流变学改变以及血糖、血脂、血黏度升高,加重动脉内膜粥样硬化的程度,从而导致脑梗塞的反复发生并加重脑梗塞的症状。为了探讨复元醒脑汤对于糖尿病脑梗塞的干预的作用机制,本课题采用糖尿病大鼠制作自体血栓性脑梗塞模型,开展复元醒脑汤对糖尿病脑梗塞大鼠胰岛素抵抗的干预作用的研究,以期从脑梗塞加重胰岛素抵抗的角度解释复元醒脑汤治疗糖尿病脑梗塞的机制,为中医药治疗老年糖尿病脑梗塞提供一定的理论和实验依据,并进一步丰富中医治疗危急重症的理论与实践。1动物脑梗塞模型本模型在链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)致糖尿病模型的基础上采用自体血栓法制备大脑中动脉闭塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)局灶性糖尿病脑梗塞SD大鼠模型。1.1材料表面1.1.1fp3实验动物中心雄性SD大鼠120只,体质量(200±20)g,SPF级,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,饲养于上海中医药大学附属龙华医院科技楼实验动物中心。动物合格证:SCXK(沪)2011-009。1.1.2益母草醇提物及其马苏烷酸酯样品复元醒脑汤(人参10g单煎、三七10g、石菖蒲12g、水蛭10g、益母草30g、生南星15g、制大黄9g后下等),由本院制剂室生产提供,浓度为388g生药/L。链脲佐菌素(STZ),Sigma,批号:040105;凝血酶,Sigma,批号:036k8600。1.1.3仪器、试剂和仪器FA2004B电子天平,上海精密科学仪器有限公司;强生血糖仪,上海强生公司;激光多普勒血流仪,深圳市瑞沃德生命科技有限公司;大鼠脑立体定位仪,深圳市瑞沃德生命科技有限公司;恒宇电热恒温鼓风干燥箱,上海跃进医疗器械厂;紫外分光光度计,美国贝克曼库尔特公司生产;微电脑电子微量注射泵,上海电子仪器厂产品。1.2方法1.2.1各组大鼠造模及灌胃SPF级SD雄性大鼠120只,根据随机原则分为2组,分别为:正常组24只和糖尿病模型组96只。糖尿病造模成功后不进行治疗,高脂饲料喂养2w后,将糖尿病大鼠随机平均分为糖尿病组、脑梗塞假手术组、模型组、治疗组4组。造模完成后分别灌胃,治疗组每日以复元醒脑汤灌胃10.4g/kg体质量(参照陈奇主编《中药药理实验方法学》依实验动物与人体表面积比计算),正常组、糖尿病组、假手术组、模型组予等容量的生理盐水灌胃,每天2次,连续3～7d。末次灌胃后,分别检测各组大鼠血糖、血清胰岛素、稳态葡萄糖输注率等指标。1.2.2stz分次注射未成模将STZ试剂溶于PH4.6的柠檬酸钠缓冲液中(现配现用),大鼠接受腹腔注射STZ试剂(50mg/kg),1w后成模(血糖>16.7mmol/L),并连续高脂饮食饲养2w。1.2.3格局内血栓形成的模型(1)制作血栓:将模型组、治疗组两组糖尿病大鼠用3%戊巴比妥钠按0.15mL/100g体质量剂量麻醉后,先暴露其股静脉抽取静脉血0.5mL加入预先加有75U凝血酶的EP管中,立即混匀。然后用注射器吸取沉淀部分注入2根头皮针塑料管内,静置15min再打进盛有生理盐水的培养皿中,洗掉凝血块表面的红细胞。在显微镜下选择富含纤维素(深色)的血栓剪切成1～2mm的小段,再转入PH7.4的PBS缓冲液中恒温(37℃)静置5h使其凝缩,然后吸入EP50管中备用。(2)制作脑梗塞模型:将大鼠依前法麻醉后用眼科镊子钝性分离出左侧颈总动脉、颈内、颈外动脉。结扎颈外动脉,用动脉夹夹闭颈总动脉和颈内动脉,用提前制备好的1mL注射器针头(将头处折一个90°的平钩)在颈外动脉上挑刺出一个小口。将吸入血栓的EP50导管由颈外动脉插入颈内动脉,松开颈内动脉上的动脉夹。缓慢将血栓注入颈内动脉,用生理盐水冲管后拔出EP50导管,结扎颈外动脉近心端。松开颈总动脉夹,缝合肌肉和皮肤。(3)假手术组不将导管插入颈外动脉,其余操作与手术组相同,手术过程中控制动物肛温在(37±0.5)℃。1.2.4模型制作、输注及输注率检测(1)血糖、血清胰岛素测定及胰岛素敏感指数:每组随机抽取6只大鼠在模型组接受自体血栓手术后12h分别用毛细玻璃管从尾静脉取血测血糖、血清胰岛素值,然后计算其胰岛素敏感指数:ISI=ln[1/(FBG×FINS)](ln为自然对数)。(2)神经缺损行为体征评分:各组分别接受治疗后3d,采用J.B.Bederson法对各组大鼠神经缺损行为评分法进行评分。待大鼠清醒后,每组随机选取12只大鼠进行评分(根据J.B.Bederson神经缺损行为体征评分法):轻提鼠尾,使其头部高于地面10cm,正常大鼠两侧前爪前伸。分级:0级(0分):无明显神经缺损症状;I级(1分):梗塞对侧前肢回收屈曲内收,同侧前肢向地面伸展;Ⅱ级(2分):I级体征+俯卧于桌面时从梗塞侧向对侧推动大鼠时阻力降低;Ⅲ级(3分):I级体征+Ⅱ级体征+大鼠行走时向梗塞对侧肢体旋转(呈追尾状),甚至倾倒。分值≥1分为模型制作成功。(3)稳态葡萄糖输注率:稳态葡萄糖输注率(glucoseinfusionrate,GIR)测定方法:各组大鼠均禁食12h,用3%戊巴比妥钠进行腹腔内麻醉(45mg/kg体质量)。麻醉显效后,将双侧项部皮肤剪开,钝性分离并暴露出右侧颈动脉和左侧颈静脉,分别在左侧颈静脉和右侧颈动脉插管:左侧颈静脉置入一支三通管,分别在其两侧各连接一个装有生理盐水的注射器,再将一支装有肝素生理盐水(浓度为40U/mL)的注射器与颈动脉导管相连,每隔5min推动一次注射器冲洗导管,防止血液凝固堵塞导管,同时用肝素系统抗凝(首次60U/kg,以后每小时25U/kg)。术中大鼠体温应控制在37℃左右,注意保温并随时用肛表监测体温。插管完毕后,将大鼠静置30min。将左侧颈静脉三通管的一侧连接一个装有胰岛素溶液的30mL注射器,另一侧接一个装有10%葡萄糖溶液的30mL注射器。将这两个注射器分别安装到两个微量注射泵上进行持续推注。先行持续胰岛素(1.5mU·Kg-1·min-1)输注5min后,从导管中取一滴血测血糖值。如果测出的血糖值超出基础值±0.5mmol/L的范围,即可进行葡萄糖输注,输注速度一般从4～6mg·Kg-1·min-1开始。如果血糖值仍保持在该范围,则在5min后再测一次血糖,直到超出上述范围至可进行葡萄糖输注为止。葡萄糖输注开始后仍旧每5-10min测一次血糖,并根据血糖值尽快调节葡萄糖输注速率,使血糖恢复到基础值±0.5mmol/L。如此反复进行。当连续3次所得血糖值均在上述范围内时,便达到胰-糖稳定状态,即所谓的“钳夹形成”,此时的葡萄糖输注速率即为稳态葡萄糖输注率。1.2.5统计学处理方法应用SPSS18.0统计软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差(ˉx±s)表示,组间均数比较采用独立样本t检验;等级资料采用Ridit分析;检验效能以P<0.05为差异具有统计学意义,P<0.01为差异具有显著的统计学意义。2结果2.1糖尿病脑梗塞模型如表1所示,正常组(N)、假手术组(S)、糖尿病组(DM)、治疗组(T)与糖尿病脑梗塞模型组(DMCI)差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。2.2显示神经缺损综合征的症状从表2可知,各组大鼠神经缺损恢复情况:糖尿病脑梗塞模型组和其他各组之间差异也具有显著的统计学意义(P<0.01)。3糖尿病脑梗塞病机糖尿病并发脑梗塞的患者多为老年人,《素问·上古天真论》云:“女子七七”、“男子八八”,“天癸绝”,肾精亏虚加之形神俱伤可为本病的发病基础。元代医家沈金鳌认为“元气虚为中风之根”;加之消渴病患者病情迁延日久,脏腑功能减退,津亏无以濡养,生化衰败,元气生化乏源,痰淤等病理产物“应运而生”。痰淤互阻堵塞脉络,导致经筋气血运行不利,日久化火生风,风火相煽,遂发“中风”。中医的认识多为“消渴病”合并“中风”,中医对于这两种疾病的发现以及认识历史悠久、经验丰富。其理论渊源最早在《黄帝内经》中就有记载,该病的病机一般以气阴两虚、脉络淤阻多见,另外还和风、火、痰、虚等病邪密切相关。我们在长期临床实践中发现,糖尿病脑梗塞的发病主要以元气虚损为根本,痰瘀互结、痰热生风为病机核心。据此,复元醒脑汤(人参、三七、水蛭、生南星、益母草、大黄等)固本培元、益气养阴为主,佐以泻热熄风、逐瘀化痰、开窍通络之法治疗糖尿病脑梗塞。前期临床研究表明复元醒脑汤治疗中风,在提高疗效,降低病死率,减轻胰岛素抵抗及改善神经功能恢复等方面取得显著效果。胰岛素抵抗高发于老年人,是机体需要分泌更高的胰岛素量以维持正常血糖水平的一种状态。近年研究发现人类的脑组织内也存在胰岛素及其受体。学界推测,脑组织内的胰岛素来源于血液中摄取和脑细胞内合成这2条途径。当机体组织细胞对胰岛素的敏感度降低,体内胰岛素水平增高时,就会导致各种代谢异常的发生。但各种组织器官的细胞对胰岛素敏感性并不一致,脂肪细胞、骨骼肌细胞较容易产生胰岛素抵抗,而肝、肾及血管等组织对胰岛素反应波动较小,高胰岛素血症的危害正是由这种不平衡所导致。诸多临床研究发现脑梗塞病人胰岛素敏感指数均低于正常对照组,说明胰岛素抵抗现象存在于脑梗塞病人体内。脑梗塞病人的高胰岛素血症并非全部来自于应激反应,而是由于梗塞区域细胞对胰岛素的敏感性下降所致,