腹腔注射2-dg对大鼠下丘脑son和室旁核神经元表达fos的影响

腹腔注射2-dg对大鼠下丘脑son和室旁核神经元表达fos的影响

脑瘫是一个重要的皮质中心，在维持身体环境平衡方面发挥着重要作用。视上核(supraopticnucleus,SON)和室旁核(paraventricularncleus,PVN)是下丘脑内重要的神经内分泌核团,主要分泌催产素(oxytocin,OT)和加压素(vasopressin,VP),通过下丘脑垂体束经垂体后叶释放入血。SON和PVN通过这两种神经内分泌激素不仅参与水盐平衡、血压稳定、生殖机能等的整合,也参与对机体各种应激反应的调节。2-脱氧-D-葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)是一种葡萄糖的类似物,系统或侧脑室给予2-DG可以阻断细胞内的葡萄糖代谢,使细胞处于类似胰岛素诱发的血糖过少(glucopenia)状态,模拟动物饥饿时的低血糖状态。Fos是一种代表神经元活化状态的即刻早期基因编码蛋白。根据Briski等的结果,腹腔注射2-DG可以诱发约50%的下丘脑外侧区(摄食中枢)神经元表达Fos。我们以往的研究结果也表明,禁食、腹腔注射2-DG和胰岛素都可引发摄食中枢神经元表达Fos,但以2-DG的诱发效果最为明显,表明2-DG是有效的“细胞饥饿”刺激方式。但2-DG能否有效激活SON和PVN的OT和VP神经元,参与体内的应激反应的调节还不清楚。因此,本研究通过腹腔注射2-DG建立“细胞饥饿”模型,采用免疫组织化学方法,观察下丘脑SON和PVN内Fos表达及其与OT和VP的双标情况,同时采用ELISA方法对血液中OT和VP的含量进行了检测。材料和方法1.动物分组、注射2-dg健康雄性SD大鼠12只,4月龄,体质量250~300g,第四军医大学实验动物中心提供[合格证号:SCXK(军)2009-0012]。随机分为腹腔注射2-DG组6只、生理盐水对照组及正常对照组各3只。腹腔注射2-DG组动物接受向腹腔内注射2-DG(剂量400mg/kg,Sigma公司),动物正常饮水,存活2h后灌注固定;生理盐水对照组腹腔注射与实验组同等剂量生理盐水,且存活时间相同;正常对照组不予任何处理。2.多聚甲醛灌注各组大鼠存活2h后,用戊巴比妥钠80mg/kg腹腔注射麻醉,开胸,经心脏取血1ml用于ELISA检测,然后经升主动脉快速插管灌注100ml生理盐水冲血,再用4%多聚甲醛(0.1mol/LPB,pH7.4)先快后慢灌流固定,持续1h左右。灌注完毕,用止血钳咬开颅骨,暴露脑组织,吻尾方向切断嗅球和脑干后取出脑组织,置于30%蔗糖溶液(0.1mol/LPB,pH7.4)4℃保存直至沉底。取脑组织行冷冻切片,厚30μm,每隔6张取1张切片,切片置于PBS(0.01mol/L,7.2)中保存。3.小鼠和小鼠中dab、ab产品的冲洗和测定切片用0.01mol/LPBS常规漂洗后,依次经以下处理:孵育在0.3%H2O2中30min,正常山羊血清(武汉博士德生物工程有限公司,1∶20)封闭1h;兔抗Fos多克隆抗体(Abcam公司,1∶500)室温过夜;生物素标记的羊抗兔血清(Chemicon公司,1∶200)室温孵育4~6h;AB复合物(Vector公司,1∶200)室温孵育1~2h;硫酸镍铵增强的DAB呈色。0.01mol/LPBS彻底漂洗后重新入0.3%H2O2处理,正常山羊血清封闭,分两组再分别依次入以下抗体:小鼠抗OT单克隆抗体(GainerH博士赠送,美国NIH,1∶100)、小鼠抗VP单克隆抗体(GainerH博士赠送,美国NIH,1∶100),室温过夜;生物素标记的驴抗小鼠血清(Chemicon公司,1∶200)室温孵育4~6h;AB复合物(Vector公司,1∶200)室温孵育1~2h,常规DAB呈色(不加硫酸镍铵)。以上各步之间均用0.01mol/LPBS充分冲洗切片3次。最后裱片、乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。阴性对照染色用PBS代替特异性一抗,其余步骤同上,染色结果未发现明显的Fos和OT、VP免疫阳性产物。4.正常羊血清封闭液制备所取血液离心后收集血清,用包被液(1∶100)稀释,100μl/孔加到酶标板中,4℃过夜。用洗涤液(0.1%吐温)清洗板子后,100μl/孔正常羊血清封闭液(武汉博士德生物工程有限公司,1∶20)37℃孵育30min。甩去封闭液,分两组每孔分别加入小鼠抗OT血清、小鼠抗VP血清37℃孵育60min,COPD+H2O237℃孵育10min,最后加入50μl终止液。每步之间均彻底清洗板子。用分光光度仪测定光度值,并设空白对照和阴性对照,以空白对照调零,数据模式为测试孔与阴性对照孔光度值之比(P/N)。5.阳性细胞分析各只动物OT、VP、Fos及双标细胞的计数,选取在SON和PVN内阳性细胞最为密集的3张,采用ImagePro-Plus专业图像分析软件,计算阳性细胞数,取其均值。数据采用统计学软件SPSS16.0处理,以均值±标准差(ue0af±s)表示,行t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。结果1.fos在son和pvn内的分布腹腔注射生理盐水可以在大脑皮层、海马等部位诱导出稀疏和淡染的Fos阳性胞核,在其他部位少见Fos阳性产物。与此相对,2-DG注射可以在脑内广泛的区域引发Fos表达。大量的Fos免疫阳性产物集中分布于下丘脑外侧区和穹窿周区,这些区域都是与摄食有关的中枢区域。另外,前脑的部分区域如内侧视前区、斜角带核、终纹床核、下丘脑前区和弓状核也有适量的Fos表达。除了以上部位,我们还在SON和PVN内观察到密集的Fos表达,Fos阳性胞核呈圆形黑色,体积较小、深染,分布密集(图1)。Fos在SON和PVN内的分布特点不同。SON内的Fos分布均匀,而PVN内的Fos多聚集在内侧部,外侧部分布较为稀疏(图1)。2.ot和pvp神经元/传导束OT和VP的免疫组织化学染色结果和以往的研究相同。在SON内,OT阳性神经元主要分布于核团的背侧方,而在PVN内主要呈包围状态分布于核团的周边,以腹侧部更为密集。VP阳性神经元在SON内主要分布于核团的腹侧,而在PVN内主要分布于核团的中央,呈现被OT神经元包围的状态。大量的OT和VP免疫阳性细胞都呈Fos阳性。双标神经元的核黑而浓染,胞质部分呈浅棕色免疫沉淀环绕在核的周围。在SON内87.10%的OT阳性神经元呈Fos阳性,而只有68.42%的VP阳性神经元呈Fos阳性;在PVN内90.57%的OT阳性神经元呈Fos阳性,而只有76.92%的VP神经元呈Fos阳性。OT/Fos在两个核团内的双标率与VP/Fos相比差异具有统计学意义(t=35.25、25.75,P<0.05)(表1,图1)。3.elisa试验结果腹腔注射2-DG大鼠血清中OT和VP的含量与对照组(腹腔注射生理盐水组)相比没有明显差别,相对值都在1左右(图2)。-dg-dg-vp神经元/激素表达下丘脑视上核和室旁核分泌的精氨酸加压素和催产素是动物体内重要的两种神经肽类应激激素,能对几乎所有的应激刺激,如心理、游泳、烧伤、热、骨折、电击、脂多糖、酒精等作出反应。饥饿也是一种应激源。禁食导致的饥饿刺激或腹腔注射胰岛素导致的低血糖刺激可以通过VP系统激活下丘脑-垂体-肾上腺皮质(hypothalamicputuitaryadrenalcortex,HPA系统)系统。2-DG是葡萄糖类似物,可抑制糖代谢过程,是有效的“细胞饥饿”刺激方式。腹腔给予2-DG可以诱发动物的摄食行为增加,说明其可导致明显的行为驱动。但这一过程是否包含应激激素VP和OT的参与尚不清楚。Fos是与神经元的激活密切相关的核蛋白。它属于即刻早期基因超家族。成熟的Fos经常与同家族的Jun组成异源二聚体而发挥转录因子的作用。一般在刺激后20~30min即可检出,60~90min达到高峰,持续2~5h,可作为神经元兴奋性的标志,是目前较为理想的研究中枢神经功能活动状态的标记物。运用免疫组织化学双染技术,我们对2-DG引发的的Fos表达进行了观察。结果显示,除了在摄食中枢可以观察到明显的Fos表达外,在下丘脑SON和PVN内也存在大量的Fos表达。Fos阳性胞核既出现在OT阳性神经元,也出现在VP阳性神经元中,以OT与Fos的双标率较高。此结果表明,腹腔注射2-DG能有效激活视上核和室旁核的OT和VP神经元从而可能参与对动物的应激行为的调节。运用ELISA方法,我们还检测了循环血中的OT和VP水平,却并没有发现明显的激素水平改变。此结果和我们以往的研究结果一致,即运用急性和慢性渴觉刺激时,急性渴觉刺激可以诱发SON和PVN大量的Fos表达,而不影响血液中的激素水平;慢性渴觉刺激既可诱发Fos表达,也显著影响血液中的激素水平。OT和VP主要由SON和PVN的大细胞部合成,通过下丘脑垂体束到达垂体后叶释放入血,部分OT和VP也可通过渗透等方式进入垂体门脉系统发挥对前叶激素的调节作用。SON和PVN虽然都具有相似的神经化学组成,但核团的细胞构筑却并不相同。SON中的细胞是均质性的大细胞,而PVN可分为背内侧的小细胞部和腹外侧的大细胞部。PVN小细胞主要合成促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropinreleasingfactor,CRF)和VP。本文观察到大量的Fos表达还出现在室旁核小细胞部,说明CRF可能也参与了这一应激过程。CRF和VP可以通过正中隆起外带释放到垂体门脉系统,作用于促肾上腺皮质激素(adrenocorticortropichormone,ACTH)细胞上的各自受体协同促进ACTH的释放,启动HPA轴。因此,要获得准确的VP和OT在应激中的变化信息,精确取血或取材部位可能尤为重要,如垂体部位的VP变化趋势可能较循环血更能精确反映此激素的动态变化。本实验的另一个发现是OT与Fos的双标率高于VP与Fos的双标率。这一结果