高效液相色谱法检测猪肠衣中4种大环内酯类抗生素残留量

高效液相色谱法检测猪肠衣中4种大环内酯类抗生素残留量

大环内酯类抗生素是一种类似于化学结构和抗菌作用的碱性抗生素。它具有大环内酯的共同结构。它以14、15和16元的大内酯结构而闻名。广泛用于家禽、昆虫和腺体感染的化疗和治疗。合理使用大环内酯类抗生素,遵守用药剂量、间隔时间和停药期规定,对于预防动物疾病、促进动物生长、控制药物残留和提高养殖经济效益都有着重要意义。然而当过量或不当使用此类抗生素时,会造成大环内酯类抗生素及其代谢产物的残留,并通过食物链进入人体,将对人类健康构成严重危害。MALs在动物性食品中的残留检测和监控与其他兽药一样已受到许多国家包括我国政府的高度重视,目前我国、日本、澳大利亚等国家以及欧盟等国际组织均对MALs提出了限量要求。大环内酯类兽药的检测方法主要有:微生物法、免疫分析法(ELISA)、薄层色谱法(TLC)、气质联用法(GC/MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法(LC/MS,LC-MS/MS)等。其中前4种方法因方法本身的缺欠,少有报导。HPLC方法是应用较广泛的一种分析方法,检测器通常为紫外检测器。Naoto报导了测定蛋和鸡肉中螺旋霉素;Marco等报导了测定猪肉、肝脏和肾脏中泰乐菌素;Dudrikova等报导了测定牛奶中泰乐菌素。近年来液质联用法检测大环内酯类抗生素的研究比较活跃,用液相色谱-串联质谱法检测牛奶、蜂王浆、蜂蜜、鳗鱼、目鱼、河水中大环内酯类抗生素的方法已有报导。肠衣基质比较复杂,有关肠衣中大环内酯类抗生素的检测,目前国内外鲜见报道,本文利用固相萃取-高效液相色谱技术,研究建立基质比较复杂的猪肠衣中大环内酯类抗生素残留量的检测方法。1材料和方法1.1萃取装置kha高效液相色谱仪(Agilent1100,配有DAD紫外检测器);固相萃取装置(Waters,12孔);旋转蒸发器:IKA公司,HB-4型;离心机:LD5-2A,转速4000r/min以上;均质器:WARING,10000r/min;氮吹仪:N-EVAPIII型,24孔。1.2酒石酸盐标准品溶液10mmol/L乙酸胺溶液(pH4.5),0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=8.5),0.25mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=7.0)。C18固相萃取小柱(500mg/6mL),Oasis(HLB)固相萃取小柱(500mg/6mL),MCX固相萃取小柱(500mg/6mL)。螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素酒石酸盐、交沙霉素标准品,纯度≥95%。4种大环内酯标准储备溶液:分别称取经折算适量标准品,分别用甲醇溶解为浓度为100μg/mL,1℃~4℃冰箱保存,临用前根据需要用甲醇稀释适当浓度的工作液。1.3提取和清洁1.3.1或加乙腈提取液制备称取5g均匀试样(精确到0.01g)置于50mL具塞离心管中,加25mL乙腈,涡旋,于4000r/min离心3min,将上层乙腈提取液收集于50mL容量瓶中,再加20mL乙腈,重复上述操作,合并乙腈提取液,加乙腈定容至50mL。精密量取10mL乙腈提取液于20mL离心管中,在45℃以下水浴减压浓缩至近干,用15mL磷酸盐缓冲溶液分次溶解残渣。1.3.2洗脱离心管C18小柱(500mg,6mL,或相当者)依次用5mL甲醇、5mL水预洗。将提取液转移过C18净化柱,弃去流出液,用5mL水和5mL甲醇-水(2∶8,体积比)依次洗涤离心管,洗涤液过C18柱,弃去流出液,负压抽干,用6mL甲醇洗脱。收集全部洗脱液,在45℃以下水浴减压浓缩至近干,加1mL甲醇-水(3∶7,体积比)溶解,混匀,过0.22μm针筒滤膜,进HPLC分析。1.4色谱柱及流动相的制备a)检测器:DAD检测器,检测波长为螺旋霉素、交沙霉素230nm,替米考星、泰乐菌素287nm;b)色谱柱:LichrospherC18柱,4.6mm×250mm(i.d),5μm;c)流动相:A为0.2%磷酸;B为乙腈;流速为1mL/min;进样量100μL;d)梯度程序:0min,20%B→15min,50%B→20min,20%B。在上述分析条件下,4种大环内酯类兽药的HPLC色谱图见图1。2结果与讨论2.1色谱柱的选择分别选用ZORBAXEclipseXDB-C85μm,4.6mm×150mm、ZORBAXEclipseXDB-C185μm,4.6mm×150mm、LichrospherC18柱,5μm,4.6mm×250mm(i.d),结果表明各种色谱柱均适用,实验选定LichrospherC18柱,5μm,4.6mm×250mm(i.d)色谱柱。2.2流动相的筛选流动相的选择对待测物质的峰形、分离度和灵敏度有很大影响。根据大环内酯的性质,流动相一般呈酸性。研究了乙腈-0.01mol/LNaH2PO4、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、甲醇-0.15%甲酸和乙腈-0.15%甲酸溶液5种流动相的色谱分离效果,选择乙腈-0.01mol/LNaH2PO4作为流动相出现杂质峰;甲醇-0.15%甲酸和乙腈-0.15%甲酸溶液作为流动相螺旋霉素和交沙霉素基线发飘、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸作为流动相各组分峰形对称、尖锐,并且达到良好分离,其中尤其以乙腈-0.2%磷酸溶液效果最好。因此采用乙腈-0.2%磷酸溶液作为流动相。2.3样品的提取方法大环内酯类兽药属于极性物质,易溶于甲醇、乙腈。实验结果表明,用乙腈、甲醇提取样品,大环内酯类兽药的回收率大于70%,两者没有显著差异,本文选用乙腈提取方法。2.4cd8和uaityhlb净化柱的净化效果实验了C18、Oasis(HLB)和MCX固相萃取柱对样品中大环内酯类兽药残留的净化效果。C18和Oasis(HLB)两种净化柱效果较好,回收率在70%~110%之间。对MCX小柱,交沙霉素不能洗脱下来。综合考虑,实验选定C18柱,淋洗条件为:5mL水和5mL甲醇-水(3∶7,体积比)依次洗涤小柱,然后用6mL甲醇洗脱。2.5标准曲线的绘制取4种大环内酯混合标准工作溶液,浓度分别为0.5、1.0、10、25μg/mL,按照上述确定的实验条件下进行分析,测定其峰面积,以质量浓度X(μg/kg)为横坐标,峰面积的比值Y为纵坐标,绘制4种大环内酯混合标准溶液工作曲线,见表1。结果表明,4种大环内酯类药物浓度与对应的峰面积呈现良好的线性关系,线性范围:0.5μg/mL~25μg/mL。按所建立的色谱条件,以3倍噪音比作为检测低限,测得本方法4种大环内酯类药物的测定低限均为0.5mg/kg。2.6回收率和精密度以不含大环内酯类药物残留的肠衣为空白样品,分别添加4种大环内酯混合标准溶液,添加浓度为1.0、5.0、10.0mg/kg3个浓度水平,按照上述方法进行6次重复试验,测得4种大环内酯类药物的回收率和精密度。平均回收率为70.2%~94.6%;变异系数为3.2%~8.9%。空白肠衣样品和添加样品的HPLC谱图见图2、图3。3抗生素的提取与检测建立了肠衣中螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素等4种大环内酯类抗生素残留量的高效液相色谱测定方法。试样用乙腈提取,C18固相萃