替米沙坦对sz诱导的糖尿病大鼠心肌线粒体膜电位变化及细胞凋亡的影响

替米沙坦对sz诱导的糖尿病大鼠心肌线粒体膜电位变化及细胞凋亡的影响

根据最近的研究，糖尿病及其并发症均有明显的裂纹膜渗透性改变。Waczulikova等也报道了糖尿病心肌病大鼠的心肌线粒体膜通透转换孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpore,MPTP)开放增多。糖尿病时线粒体活性氧(ROS)产生增多、Ca2+超负荷等均可导致MPTP的开放。线粒体膜电位(ΔΨm)下降是细胞凋亡的特异性改变,也是细胞凋亡早期的一个关键性变化。替米沙坦已广泛应用于原发性高血压的治疗,近年研究显示其对糖尿病心肌亦起保护作用,但研究仅局限于改善心肌纤维化及糖脂代谢紊乱等方面。本研究旨在通过观察替米沙坦对糖尿病心肌ΔΨm变化的影响,探讨其对糖尿病心肌细胞凋亡的作用,以及线粒体膜电位在此过程中的变化情况。1材料和方法1.1试剂与仪器链脲佐菌素(streptozotocin,STZ,S0130,美国Sigma),替米沙坦(苏州东瑞医药公司惠赠),ΔΨm试剂盒(JC-1法,美国Invitrogen),线粒体活性氧试剂盒(上海杰美基因医药公司),低温高速离心机(TGL-16M,湖南湘仪),F-7000型荧光分光光度计(日本HITACHI),光学显微镜(日本Olympus)。1.2模型建立及分组健康成年雄性Wistar大鼠,SPF级,体重400±20g,由南京军区南京总医院动物实验中心提供,许可证号:SCXK-(军)2007-004。大鼠一次性腹腔注射50mg/kgSTZ,以72h、7d后随机血糖浓度≥16.7mmol/L作为1型糖尿病模型建模成功的标准。16只成模大鼠随机分为糖尿病(DM)组和替米沙坦(T)组,每组8只;另选取8只健康大鼠作为正常对照(Con)组,予腹腔注射等体积的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。T组于每天上午给予替米沙坦8.34mg/(kg·d)灌胃,并测量体重以调节给药剂量;DM组及Con组均予等体积生理盐水灌胃。各组大鼠继续原条件喂养12周后结束实验。1.3随机糖和体重测定采用血糖仪测定STZ注射后7d和12周时大鼠血糖水平;普通天平测定各组大鼠12周时终末体重。1.4差速离心法分离染色体悬液参考文献的步骤进行。实验结束时,将大鼠断头处死,迅速开胸取出心脏,剪取左心室前壁心室肌50～200mg,置于预冷的分离介质(0.23mol/L甘露醇,0.07mol/L蔗糖,1mmol/LEDTA,10mmol/LTris-HCl,pH7.4)中,洗去血液,充分剪碎、匀浆(以9ml/g比例进行),采用差速离心法分离线粒体:即以1000×g离心10min,弃沉淀;上清经10000×g离心10min,弃上清;用分离介质悬浮沉淀,再次以10000×g离心10min,其沉淀以分离介质悬浮即制成线粒体悬液,以上操作均在0～4℃进行。线粒体蛋白定量采用Bradford法,线粒体用量根据其蛋白含量决定。1.5dcfh-da反应取大鼠心肌线粒体悬液150μl(含线粒体蛋白50μg),按试剂盒说明书操作,加入琥珀酸钠3.3mmol/L,然后加入终浓度为5μmol/L的DCFH-DA,反应总体系为3ml,避光水浴15min后,立即于荧光分光光度计下测定900s(激发波长488nm,发射波长525nm),测试过程保持37℃恒温。线粒体ROS产生速率以线粒体样本荧光强度随时间变化的数据点线性回归直线斜率减去本底荧光强度随时间变化的数据点线性回归直线斜率表示,以fluorescenceunits/(s·mgpro)表示,简写为U/(s·mg)。1.6限制差质体悬液体系采用JC-1法检测,参照文献略加改进。用膜电位反应缓冲液(0.21mol/L甘露醇,0.07mol/L蔗糖,5mmol/LHEPES,pH7.4)悬浮分离好的线粒体悬液(含线粒体蛋白50μg),缓冲体系为2ml,各组分别设阴性对照。加入1μl解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙(carboxylcyanidemchlorophenylhydrazone,CCCP)30℃孵育10min,随后加入0.2mmol/LJC-1染色液3μl,室温避光10min,荧光分光光度计检测其荧光强度[激发波长488nm下的荧光强度-发射波长590nm下的荧光强度,结果以相对荧光单位(RFU)表示。1.7心肌细胞凋亡指数石蜡包埋切片,采用TUNEL法按试剂盒说明书操作,光镜下计数凋亡细胞数目,并计算心肌细胞凋亡指数(AI)。每组随机抽取6张切片,400倍高倍镜下应用BIOMIAS图像分析系统摄像,每张切片连续摄取5个视野,计数5个高倍镜视野中凋亡心肌细胞核数目,并计算其与心肌细胞核总数比值的平均值,作为AI。1.8统计处理采用SPSS17.0统计软件进行分析,计量资料以x¯±sx¯±s表示,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1各组大鼠体重、比,总体重含量给予STZ注射7d后,DM组、T组大鼠间血糖差异无统计学意义(P>0.05),但均显著高于Con组(P<0.01);DM组、T组大鼠体重显著低于Con组(P<0.01),但与DM组比较,T组体重降低更明显(P<0.05)。12周时,DM组与T组大鼠血糖、体重差异均无统计学意义(P>0.05,表1)。2.2心肌m的变化与Con组比较,DM组、T组ROS水平均显著升高(P<0.01),而T组显著低于DM组(P<0.01)。与Con组比较,DM组、T组心肌ΔΨm均显著下降(P<0.01),但T组与DM组比较显著回升(P<0.01)。与Con组比较,DM组心肌细胞AI显著升高(P<0.05),T组无明显变化(P>0.05),但与DM组比较,T组心肌细胞AI显著降低(P<0.05,表2)。3替米沙坦在大鼠心肌组织病理学改变时表1,本研究结果显示,12周时,光镜下可见DM组大鼠心肌细胞凋亡增多,与以往研究相符,且心肌ΔΨm下降明显,线粒体ROS产生速率显著增加。ΔΨm可以反映MPTP的开放程度以及线粒体膜的损伤程度,ΔΨm下降是细胞凋亡的关键性改变。有研究发现,糖尿病心肌病变时,Ca2+内流增加,肌浆内Ca2+超负荷,而Ca2+与MPTP内侧的2个Ca2+结合位点结合后,可使其构象发生改变,导致MPTP高水平开放;同时糖尿病状态下心肌线粒体ROS生成增多,而ROS标准氧化还原电位高,氧化能力强,它通过耗竭还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)或NADPH,使电化学梯度显著降低,从而诱发MPTP的异常开放。MPTP异常开放时直径明显增大,达到1.8～2.6μm,且呈持续状态,从而造成线粒体内相对分子质量小于1.5kD的物质(如基质内的离子、溶质小分子及某些蛋白质)通过MPTP释放入胞质,内膜两侧离子梯度消失,线粒体膜去极化,最后使膜电位降低。同时线粒体还释放细胞色素C(cytrochomeC,Cyt-c),一旦进入胞质,可在ATP或dATP的协同作用下与凋亡蛋白酶活化因子1(apoptosisprotease-activatingfactor-1,Apaf-1)结合并使其分子结构改变从而激活caspase-9,活化的caspase-9又可激活其下游的caspase-3等酶系,引发caspases级联反应,导致心肌细胞凋亡。糖尿病状态下,肾素-血管紧张素系统(rein-angiotensinsystem,RAS)系统被激活,血浆及心肌局部的AngⅡ合成增加,而有研究观察到AngⅡ介导的氧化应激可诱导糖尿病大鼠心肌细胞发生凋亡。替米沙坦是一种特异性的AT1受体拮抗剂,近年来在糖尿病心肌保护方面的报道颇多,主要认为其可抑制AngⅡ与AT1受体结合,改善糖尿病心肌纤维化,另外,还可选择性地激动过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ),改善糖脂代谢,从而发挥心肌保护作用。本研究结果显示,替米沙坦组大鼠ΔΨm较DM组有所回升,ROS产生速率有所下降,心肌细胞凋亡亦有显著减少。同时,本文作者观察到替米沙坦可降低糖尿病大鼠机体的氧化应激水平,提示其还可能通过降低糖