苏木素伊红染色法的应用

苏木素伊红染色法的应用

苏木-伊红染色是一种用普通光学显微镜观察和识别细胞死亡和细胞坏死的染色方法。1染色的进行:分化和蓝化苏木素容易被氧化,其氧化产物苏木红(haematein)才是真正的染料。习惯上称苏木素是碱性染料,实际上,苏木红是一种酸性染料,只有苏木红和铝结合形成一种带正电荷的蓝色色精才是碱性的。带正电荷的蓝色色精和细胞核结合是通过正、负电荷的极性吸附来完成的,也就是说,带负电荷的脱氧核糖核酸根和带正电荷的蓝色色精进行极性吸附而完成染色。染色后必须进行分化(differenciation)和蓝化(blueing)处理。所谓分化,就是用某些试剂,将过度染色的或不需要着色的组织成分上的颜色除去,所谓蓝化是指用明矾苏木素液深染细胞核后,通过盐酸乙醇分化,切片从酸性环境中(此时切片呈红褐色)转移至流水中使之变蓝的现象,本质上是染料苏木红加铝(蓝色色精)之间的结合或中断关系。一般来讲,在酸性环境中,使深蓝色的色精处于离子状态,此时为红色。这种现象称为色精形成中断。相反,红色离子状态的色精在碱性环境中(相对地)处于结合状态,这种现象称色精形成,并呈现蓝色。伊红Y(四嗅荧光素二钠盐)是一种酸性红色胞浆性染料,含有1个醌型苯环的发色基和2个形成钠盐的酸性助色基,伊红Y溶于水中就能离解成带负电荷的色酸部分,即染料的有色部分;带正电荷的钠离子部分,即染料的无色部分。酸性染料组织成分呈弥漫性染色,这是由于组织成分的等电点一般都在3.6~5.2范围内(细胞核,pH3.8~4.2;细胞浆pH4.6~5.0)它们在弱酸性或弱碱性不可能进行极性吸附而完成染色,它们的染色可能是通过渗透作用或弥散作用而完成的,因此和组织成分结合是不牢固的。2试剂和制备2.1苏苏叶的检测苏木素2.5g纯乙醇25.0mL钾明矾2.5g氧化汞1.2g冰乙酸20.0mL蒸馏水500.0mL先将苏木素溶于乙醇中(稍加热),将预先已溶解明矾的蒸馏水加入苏木素乙醇液中,然后将其加热使溶液尽快沸腾后,将火焰熄灭,慢慢加入氧化汞,防止溶液溅出,再煮沸2min后将烧瓶立即浸入冷水中,当染液冷却后,加入冰乙酸室温保存,用前过滤。2.2冰乙酸溶液ld50伊红Y0.5~1.0g,蒸馏水75mL,95%乙醇25mL,冰乙酸1~2滴。先取少许蒸馏水加入伊红,用玻棒将伊红研碎,再加入全部蒸馏水溶解后加入乙醇。2.3盐酸乙醇分离液盐酸0.5mL,体积分数75%乙醇100mL,将两种液体小心混合而成。2.4其他二甲苯3方法3.1乙醇制备工艺1)取材组织块,经固定后,常规石蜡包埋,4μm切片;2)切片常规用二甲苯脱蜡,经各级乙醇至水洗:二甲苯(Ⅰ)5min※二甲苯(Ⅱ)5min※体积分数100%乙醇2min※体积分数95%的乙醇1min※体积分数80%的乙醇1min※体积分数75%的乙醇1min※蒸馏水洗2min;3)苏木素染色5min,自来水洗1min;4)盐酸乙醇分化30s;5)自来水浸泡15min或温水(约50℃)5min;6)置伊红液2min;7)常规脱水、透明、封片:体积分数95%的乙醇(Ⅰ)1min※体积分数95%的乙醇(Ⅱ)1min※体积分数100%乙醇(Ⅰ)1min※体积分数100%乙醇(Ⅱ)1min※二甲苯石碳酸(3∶1)1min※二甲苯(Ⅰ)1min※二甲苯(Ⅱ)1min※中性树脂封固。3.2细胞成像或细胞涂料的he染色3.2.1细胞调空,调整细胞数对于贴壁生长的细胞(包括肿瘤细胞),让其在盖玻片在上面爬行生长。经药物处理诱导细胞凋亡后,取出盖玻片经PBS轻轻漂洗后,用体积分数4%的甲醛或多聚甲醛在常温下固定5~10min,即可染色,对于悬浮生长的细胞(包括肿瘤细胞)或贴壁生长的细胞经消化脱壁成单细胞悬液后,可经细胞涂片后染色,细胞经药物或其他因素处理诱导细胞凋亡后,离心(1000转/min)收集,PBS洗1~2次,调整细胞数[(1~15)×104mL]。取100μL,用细胞涂片离心机(1000r/min,1~2min)制成细胞涂片,用体积分数4%的甲醛或多聚甲醛在常温下固定5~10min,即可染色。3.2.2染色方法同石蜡组织切片的HE染色,免去第1和第2步4结果与评价的分析4.1凋亡细胞的组织形态光学显微镜下细胞核呈蓝黑色,胞浆呈淡红色,凋亡细胞在组织中单个散在分布,表现为核染色质致密浓缩,核碎裂等。坏死组织则呈均质红染的无结构物质,核染色消失。4.2细胞凋亡pb和甲基绿-派诺宁染色在细胞爬片上,凋亡的细胞变圆,变小,可见细胞核固缩、碎裂,染色体被染成深蓝色或蓝黑色;可见细胞膜皱褶,卷曲和出泡,以及芽生形成膜包裹的凋亡小体,而正常的细胞经染色仍然保持原有的生长形状(如梭形或多角形等),细胞核完整,染成均一蓝色,细胞涂片时,可见凋亡细胞核固缩、碎裂、染色变深;正常细胞染色体均匀淡蓝色或蓝色,而坏死细胞则细胞肿胀,可见细胞膜的连续性破坏,核染色体染成很淡的蓝色甚至消失。此外,根据研究的目的、材料的不同,还有一些其他的染色方法,例如,细胞凋亡是一种细胞程序性死亡的过程,需要有细胞内蛋白酶的激活,细胞质内常有mRNA表达的增强,而细胞坏死则是一种被动的细胞死亡过程,细胞内常有RNA的损失。根据这一特点,可应用试剂甲基绿对DNA染色的特异性和派诺宁对RNA的亲和性,使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着色,如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳