白细胞介素-1对应激大鼠ang及其a1r表达的影响

白细胞介素-1对应激大鼠ang及其a1r表达的影响

慢性休克不仅严重影响人们的身心健康，而且还参与和促进身体的老过程，导致各种形式的情绪疾病、肠功能紊乱、自身免疫性疾病和癌症。研究表明,在各种应激情况下,循环与组织(包括下丘脑)血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)含量显著增高,在免疫刺激或应激时,可观察到脑干、下丘脑等部位IL-1β(interleukin-1β,IL-1β)mRNA表达增加以及IL-1β含量升高。然而,IL-1β在应激之后的改变是否与室旁核(paraventricularnucleus,PVN)内AngⅡ的改变存在相互作用,则未见报道。为此,本研究运用免疫组化的方法探讨IL-1β对应激大鼠PVNAngⅡ及AT1R表达的影响,为揭示应激损伤、应激性疾病的中枢机制及进一步防治应激性疾病提供理论依据。1材料和方法1.1动物48只雄性Wistar大鼠,体重(280±20)g,3月龄,由吉林大学基础医学院实验动物中心提供。1.2方法1.2.1主试剂IL-1β和IL-1β抗体购自Sigma公司,SP试剂盒购自福州迈新试剂公司,DAB显色试剂盒购自吉林博大生物技术有限公司。1.2.2大鼠足跖部电刺激48只大鼠随机分为正常组和应激组,每组24织。正常组大鼠放进电击笼,不给予任何刺激,应激组大鼠每天给予电击足底结合噪声刺激,给予计算机控制的随机性足底电刺激,电流强度为2～4mA,电压输出为75～150V,脉冲间隔为5～30s,波宽50～100ms,同时伴随一个噪音(80～100dB,时程50ms)刺激,每天2次,每次2h,连续刺激15d。1.2.3大鼠不锈钢管回复突变试验大鼠经20%氨基甲酸乙酯(1.4g/kg)腹腔麻醉后,用脑立体定位仪按Paxions和Walson图谱,于前囟后1.0mm,旁开1.5mm,深4.2mm,将外径为0.5mm的不锈钢管插入,用牙托粉固定,埋管2d后,经侧脑室埋管给药。正常组大鼠分为A、B、C三个亚组,每亚组8只,经侧脑室A组注入生理盐水、B组注入IL-1β1.0mg/L、C组注入5.0mg/L各10μl;应激组大鼠分为A1、B1、C1三个亚组,每亚组8只,经侧脑室A1组注入生理盐水、B1组注入IL-1β抗体50mg/L、C1组注入100mg/L各10μl,3～5min恒速注毕,90min后,断头取脑进行组化分析。1.2.4血小板中过氧化物酶活性测定以20%氨基甲酸乙酯(1.4g/kg)腹腔麻醉,开胸,经心脏灌流,先用100ml生理盐水快速灌注后,然后用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液300ml灌流。开颅取脑组织放入固定液(4%多聚甲醛溶液)中固定6h,再浸入30%的蔗糖0.1MPBS(pH7.2)中,4℃过夜,根据解剖标志切取约4mm厚含有PVN的组织块,用冰冻切片机切连续全脑冠状切片,每4张取1张,片厚40μm。切片先用PBS液(pH7.4)漂洗3min×3次后,于微波炉内中高火加热至沸腾后继续加热15min,自然冷却至室温,冲洗后擦干;滴加50μl的3%过氧化氢溶液,室温下于湿盒中孵育10min,以阻断内源性过氧化物酶的活性;再冲洗,滴加特异性第一抗体覆盖组织,室温下孵育90min;冲洗,除去PBS液;滴加生物素标记的第二抗体,室温下孵育30min;每张切片加50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液,室温下孵育20min;用二甲基联苯胺(DAB)显色液显色10min;苏木素复染,冲洗返蓝;切片贴于涂有铬矾明胶的载破片上,37℃烘干过夜,常规脱水、透明、中性树胶封固。1.3细胞表型的检测在OlympusBH-2显微镜40倍物镜下,随机选取5个相邻视野阳性细胞平均百分数作为每张切片的结果,用计数器计数PVNAngⅡ和AT1R的阳性细胞数,阳性细胞数占总细胞总数>10%为阳性。实验数据用x¯±sx¯±s表示,采用单因素方差分析。采用显著性t检验作统计学处理。2结果2.1侧脑室il-1对pvn表达的影响在对照组中,PVN内AngⅡ和AT1R阳性细胞数量均很少,染色较淡;侧脑室给予IL-1β后,PVN内AngⅡ和AT1R阳性细胞数量明显增多,而且染色加深,尤其以IL-1β5.0mg/L作用更为明显,与对照组比较有显著差异(P<0.05或P<0.01)(表1)。2.2应激大鼠pvn的细胞术检测ang和at1r表达应激大鼠PVN内AngⅡ及AT1R有大量的表达,而在给予IL-1β抗体后,应激大鼠PVN内的AngⅡ和AT1R阳性细胞的胞浆染色面积明显减少,与对照组比较有显著差异(P<0.05)(表2)。3应激对il-1和ang表达的调节作用应激主要是通过神经-内分泌-免疫网络引发一系列的神经、内分泌、免疫和行为等变化,释放多种神经递质或调质,影响大脑的某些脑区,如PVN、海马、蓝斑核等的功能,引起这些脑区的功能紊乱,甚或器质性损伤,从而导致各类应激性疾病的发生。中枢IL-1β不仅是经典促炎因子,也是中枢神经系统内分布广泛,并具有多样性生理调节功能的细胞因子,在应激反应引发的多种生理与病理过程中起关键作用。中枢IL-1β主要由脑内巨噬细胞、脑血管内皮细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞以及神经元所分泌,其免疫活性细胞及神经纤维主要分布于下丘脑的PVN、腹内侧核、弓状核、视上核、穹隆下器官、齿状回及海马等部位。文献报道,在免疫刺激或应激时,可观察到脑干、下丘脑等部位IL-1βmRNA表达增加以及IL-1β含量升高。以往研究证实,足部电击刺激可引起大鼠下丘脑IL-1β含量升高。PVN是应激反应的重要核团,也是应激激素作用的主要靶区,它通过其神经分泌系统应答多种刺激引起机体的变化,维持机体内外环境的平衡。现已明确,下丘脑存在有AngⅡ免疫阳性细胞及大量AT1R,其中PVN是分布密度最大的核团之一。大量实验研究表明,在各种应激情况下,血及脑组织(尤其是下丘脑)中AngⅡ含量均显著增高,而AngⅡ的生物效应主要是激活神经细胞上的AT1R,因此,各种应激刺激因素引起IL-1β或/和AngⅡ升高时,AngⅡ和IL-1β可能会直接作用于中枢的神经元,或者通过改变其它神经递质或调质的释放,或者通过刺激某些受体来影响机体活动的调节导致应激反应。本实验结果显示,在正常基础状态下,PVN内AngⅡ及AT1R表达量较低,受到IL-1β作用后,引起PVN内AngⅡ及AT1R大量表达,其阳性细胞的数量和强度较正常增高和增强,突起染色的长度延长。应激大鼠AngⅡ及AT1R在PVN内有广泛的表达,阳性细胞数量较多,在给予IL-1β抗体后,AngⅡ和AT1R阳性细胞的数量及胞浆着色面积明显减少。由此推测,IL-1β和AngⅡ在中枢神经系统内的作用相互关联,IL-1β对下丘脑PVNAngⅡ呈正向调节作用,导致AngⅡ合成和/或释放增加,同时说明了IL-1β可促进AT1R上调,这与Gurantz等研究的IL-1β可通过激活NF-kappaB增加大鼠心肌的AT1R的密度,以及Yoshida等报道的IL-1β呈剂量依赖性刺激星形胶质细胞AT1R的表达增强结果一致。IL-1β对AngⅡ及AT1R