替米沙坦对东碱模型小鼠学习记忆及脑内胆碱能神经的影响

替米沙坦对东碱模型小鼠学习记忆及脑内胆碱能神经的影响

阿尔茨海默病（ad）是一种以认知记忆功能减退为主要临床表现的致命神经退行性疾病，主要表现为认知记忆功能低下。其主要病理特征是：体积样本蛋白（a））积聚和脑内胆碱损失。AD发病率随着人类现代化和老年化进程的加速而逐年攀升,并且有不断年轻化的趋势,给家庭和社会面带来沉重的负担。目前临床上治疗药物的种类和疗效十分有限,而市场需求逐年增加。因此,寻找更有效的防治AD的药物具有重要意义。替米沙坦是1型血管紧张素Ⅱ受体(AT1R)拮抗剂,临床上常用于治疗高血压病。近些年来,文献不断报道,AT1R拮抗剂如缬沙坦、氯沙坦、替米沙坦等可显著改善转基因痴呆模型小鼠或Aβ诱导的痴呆模型动物学习记忆损害,但AT1R拮抗剂是否可以通过提高中枢胆碱能神经系统功能改善学习记忆损害目前尚未见文献报道。本研究采用东莨菪碱诱导的痴呆模型,探究替米沙坦对对东莨菪碱模型小鼠学习记忆及脑内胆碱能神经的影响,为进一步研究AT1R拮抗剂防治AD奠定基础。1材料表面1.1y迷刺激器、紫外/可见分光光度计Morris水迷宫(上海吉量软件科技有限公司);MG-3S型Y迷宫刺激器(淮北正华生物仪器设备有限公司);16/18型紫外/可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);酶标分析仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)。1.2以sco盐酸替米沙坦(telmisartan,Tel,江苏亚邦爱普森药业有限公司,批号1105012);东莨胆碱注射液(scopolamine,Sco,上海禾丰制药有限公司,批号120503);盐酸多奈哌齐(安理申,aricept,Ari,卫材(中国)药业有限公司,批号110208A);羧甲基纤维素钠(CMC-Na,国药集团化学试剂有限公司,批号20091221);乙酰胆碱试剂盒、乙酰胆碱酯酶试剂盒及考马斯亮蓝试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。1.3动物质量合格情况ICR小鼠,雄性,清洁级,体质量(20±2)g,共40只,由扬州大学比较医学中心提供,动物质量合格证号:SCXK(苏)2007-0001。2方法2.1分组及治疗方法取清洁级ICR小鼠40只,体质量18～22g,按体质量随机分为5组,即Sal+Veh组、Sco+Veh组、Sco+Ari组、Sco+Tel(0.70mg·kg-1)组、Sco+Tel(0.35mg·kg-1)组,每组8只。Sco+Veh组、Sco+Ari组、Sco+Tel(0.70mg·kg-1)组、Sco+Tel(0.35mg·kg-1)组腹腔注射东莨菪碱(Sco,1.0mg·kg-1),Sal+Veh组腹腔注射等体积的生理盐水(Sal)。30min后灌胃给药,Sco+Ari组灌胃给予安理申(Ari,2mg·kg-1),Sco+Tel(0.70mg·kg-1)组和Sal+Tel(0.35mg·kg-1)组灌胃给予替米沙坦,Sal+Veh组和Sco+Veh组给予等体积的0.5%CMC-Na。腹腔注射和灌胃给药均每天1次,连续17d。2.2水迷平台训练给药第8天进行Morris水迷宫试验,为期6d,第1,2天为可见平台训练,第3,4,5天为隐藏平台训练,第6天为空间搜索试验。水迷宫试验期间每天继续给药,于灌胃给药30min后进行试验。(1)可见平台训练:将插有旗子的水迷宫平台(旗子高于平台5cm)置于水迷宫第4象限,放入25℃左右水至没过平台5mm。每天从1,2,3,4四个象限(4个入水点)分别将小鼠面向池壁放入水中,使其自由游泳90s,90s内小鼠找到平台并上台停留10s后将其从平台上取下休息,计算机监测并记录小鼠从入水开始至爬上平台所需的时间(潜伏期)及穿越平台的次数等数据。若90s内动物未找到平台,则将小鼠引到平台,并停留30s,潜伏期记为90s。(2)隐藏平台训练:将未插有旗子的水迷宫平台置于水迷宫第4象限,放入25℃左右水至没过平台5mm。训练方法同可见平台训练。(3)空间搜索试验:试验第6天撤除平台,任选一象限将各组小鼠依次从该象限面向池壁放入水中,使其自由游泳90s,记录小鼠在第4象限停留的时间占总时间的百分比(行为学测试过程中应保持光线柔和,房间安静,各参照物位置不变)。2.3y迷觉神经并诱导试验Morris水迷宫试验后进行Y迷宫试验,Y迷宫电压设置10V,电击延迟时间为2s,试验为期2d,第1天为训练,首先将小鼠放入Y迷宫,适应环境5min,然后将小鼠置于某一臂作为起点区,进行电击,其一次逃至安全区为正确反应,否则记为错误反应。电击每次间隔30s,依次重复,连续训练10次。第2天为测试,此次无需适应5min,实验操作和方法同第1天,记录小鼠在连续10次电击中的正确逃避次数。2.4ach含量测定将小鼠断头取脑,用预冷生理盐水冲洗表面血液,分离海马和皮层,取一部分样本以质量/体积比1∶9加入裂解液,制成约10%匀浆,3500r·min-1、4℃离心15min,取上清液,按试剂盒说明规定的方法测定ACh含量。另一部分样品以质量/体积比1∶9加入4℃生理盐水,制成约10%的匀浆,3500r·min-1、4℃离心15min,取上清液,按试剂盒说明规定的方法测定AChE含量。并用考马斯亮蓝定量蛋白。2.5.5统计分析所有数据均用x¯±sx¯±s表示。采用SPSS11.5软件进行分析,数据比较采用方差分析。P<0.05表示差异有显著性,P<0.01表示差异有极显著性。3小鼠在原平台所在限定停留时间百分率和穿越平台次数试验在可见平台训练中,各组小鼠的训练潜伏期无显著差异(P>0.05,n=8),见图1,说明各组小鼠对目标的识别能力和色觉均正常。在隐藏平台试验中,试验第2天,Sal+Veh组和Sco+Ari组潜伏期均小于Sco+Veh组,具有统计学意义(P<0.05,n=8),试验第3天,Sco+Tel(0.70mg·kg-1)组和Sco+Tel(0.35mg·kg-1)组小鼠的潜伏期均小于Sco+Veh组,具有统计学意义(P<0.01,n=8),见图2。在空间探索试验中,Sco+Tel(0.70mg·kg-1)组和Sco+Tel(0.35mg·kg-1)组小鼠在原平台所在象限停留时间百分率及穿越平台次数均显著大于Sco+Veh组(P<0.05,P<0.01,n=8),见图3～5。如图2所示,Sco+Tel(0.70mg·kg-1)组和Sco+Tel(0.35mg·kg-1)组较Sco+Veh组正确反应次数显著增加(P<0.05,P<0.01,n=8),见图6。Morris水迷宫和Y迷宫试验结果提示,替米沙坦(0.35～0.70mg·kg-1)对东莨菪碱模型小鼠学习记忆损害有显著改善作用。与Sco+Veh组比较,Sco+Tel(0.70mg·kg-1)组和Sco+Tel(0.35mg·kg-1)组小鼠脑组织海马区和皮层区ACh含量显著增多(P<0.05,P<0.01,n=4),而AChE活力显著下降(P<0.05,n=4)(表1),提示,替米沙坦可抑制东莨菪碱模型小鼠脑内AChE活性,提高ACh含量。4东碱模型小鼠学习记忆损害的活性基底前脑胆碱能神经元退变、丢失是AD患者学习记忆损害的主要原因之一,ACh及其受体在调节学习记忆活动中发挥着十分重要的作用。提高ACh及其受体功能的药物如胆碱酯酶抑制剂(多奈哌齐、利斯的明等)是目前临床上治疗AD的一类重要药物。东莨菪碱为非选择性M受体阻断剂,可以通过血脑屏障进入中枢,阻断中枢ACh与其受体的结合,破坏大脑皮层和海马等部位的胆碱能神经信号传递,使学习记忆功能下降。东莨菪碱用于诱导动物记忆损害模型具有简单、经济、方便等优点,故常应用于抗AD活性化合物的初步筛选。AT1R拮抗剂替米沙坦脂溶性较高,较其他AT1R拮抗剂更易通过血脑屏障。值得注意的是,我们使用的替米沙坦剂量非常低(0.35～0.70mg·kg-1·d-1),仅相当于抗高血压剂量的1/60～1/30,因此,替米沙坦改善东莨菪碱模型小鼠学习记忆损害的同时不影响血压。本研究发现,替米沙坦通过降低AChE活性提高胆碱能神经递质ACh含量,改善东莨菪碱模型小鼠学习记忆损害。