室旁核对神经源性肺水肿发病的影响

室旁核对神经源性肺水肿发病的影响

神经源性肺水肿（npe）是一种复发于中枢神经系统损伤的疾病。例如，常见的脑损伤、蛛网膜下腔出血、树干损伤、急性脑缺血和缺氧脑损伤可合并肺水肿。以严重的情况、快速的进步和低效率为特征。以往研究表明交感神经兴奋,引起血液动力学的改变是NPE主要的外周原因,而中枢神经系统病变导致NPE的病理机制尚不十分清楚。组胺是中枢神经递质,脑内组胺能神经元胞体主要分布于下丘脑结节乳头体核,其神经纤维及受体在脑内分布较广泛,除了参与机体的多种功能调节外,还与多种中枢神经系统疾病及其并发症的发生有关。本实验观察NPE家兔模型室旁核(PVN)内组胺含量变化,探讨组胺在NPE发生过程中的作用,为揭示NPE发生的中枢机制以及对该病的预防和治疗提供理论支持。1材料和方法1.1试剂和仪器成年健康家兔60只,体质量2.0～2.4kg,雌雄不拘,由东南大学医学院实验动物中心提供。组胺二磷酸标准品系Sigma公司产品,甲醇为国产色谱纯,磷酸和三氯乙酸为国产分析纯,凝血酶系浙江杭康海洋生物药业股份有限公司产品,纤维蛋白原系上海莱士血制品有限公司产品,扑尔敏系江苏盐城制药有限公司产品,西米替丁系江苏鹏鹞药业有限公司产品;蛋白质定量试剂盒系南京建成生物制品公司产品;LC-6A型高效液相色谱仪为日本岛津公司产品;722分光光度计由上海分析仪器厂生产。1.2方法1.2.1pvn的注射实验动物随机分为空白对照组(空白组)、假手术组、NPE模型组(NPE组)、H1受体拮抗剂组(H1组)、H2受体拮抗剂组(H2组)、生理盐水组(NS组),每组10只家兔。空白组:动物麻醉(25%乌拉坦4ml/kg)后仅行气管、动脉插管;NPE组:动物麻醉后气管、动脉插管,在脑立体定位仪下行小脑延髓池穿刺注射凝血酶35U/kg和4%纤维蛋白原20mg/kg;H1组、H2组、NS组:参照Sawyer兔脑立体定向图谱在脑立体定位仪下PVN埋置外套管(直径0.6mm),用自凝牙托粉及502胶固定,小脑延髓池穿刺注射凝血酶和纤维蛋白原,经内套管(直径0.3mm)分别向PVN注射扑尔敏(10μg)、西米替丁(10μg)及等体积(1μl)的生理盐水;假手术组:小脑延髓池穿刺后不注射任何液体拔针。1.2.2组织匀浆、过滤实验结束后,将动物放血处死,根据Sawyer兔脑立体定向图谱迅速于冰台上取PVN,精确称重后,置于玻璃匀浆器中,加入预冷的10%三氯乙酸,制成1%组织匀浆,4℃、14000r/min离心10min,取上清液经0.45μm滤膜过滤后-20℃冰箱保存。用高效液相紫外线检测法测定组胺含量,根据组胺标准品峰面积和浓度的关系绘制标准曲线,得线性方程,根据方程计算样品中组胺的含量(nmol/g)。1.2.3膜法检测水肿蛋白表达水平实验结束后自动物颈总动脉取血3ml,置于肝素化的离心管中,收集肺水肿液3ml,将水肿液和血液分别3000r/min离心10min,取上清液-20℃冰箱保存待测。用Lowery法测定蛋白含量,严格按照试剂盒说明书进行。根据公式:A/P=肺水肿液蛋白含量/血浆蛋白含量,计算A/P值。1.2.4肺湿重的测定动物处死后,开胸取肺组织,根据肺水肿的程度将肺水肿分为4级:严重水肿(3个肺叶以上至两肺严重瘀血、水肿)、中度水肿(水肿仅波及3个肺叶)、轻度水肿(仅有肺尖部水肿或两肺散在灶性水肿)、未见水肿(未发现眼观可见的水肿);准确称取肺湿重后将标本置于70℃烤箱中烤48h至恒重,称取肺干重。根据公式:肺水比=(肺湿重-肺干重)/肺干重,计算肺水比。1.2.5统计方法实验数据以均数±标准差(±s)表示,统计学处理用SPSS10.0软件进行。组间比较用t检验或χ2检验。2结果2.1各组大鼠nmol/gNPE组、NS组、空白组和假手术组PVN内组胺含量分别为(321.81±25.77)、(332.96±26.06)、(136.45±23.59)、(157.12±17.51)nmol/g,NPE组和NS组与空白组和假手术组比较差异均有极显著性(均P<0.001);而NPE组和NS组比较以及空白组和假手术组比较差异均无显著性(均P>0.05)。2.2血清bs-p值空白组和假手术组动物无肺水肿液,肺内少量液体的蛋白含量小于血浆蛋白的60%。NPE组、NS组、H2组动物出现肺水肿液,H1组也有动物出现少量肺水肿液,A/P值分别为0.80±0.15、0.81±0.10、0.78±0.12和0.58±0.14,H1组动物A/P值明显低于NPE组和NS组、H2组(均P<0.01),而H2组与NPE组和NS组比较差异均无显著性(均P>0.05)。2.3两组比较结果H1组动物肺水肿程度与NPE组比较明显减轻(P<0.01),而H2组与NPE组比较差异无显著性(P>0.05)。见表1。H1组动物肺水比与空白组、假手术组比较差异无显著性(均P>0.05),NPE组、NS组和H2组肺水比均明显高于H1组、空白组和假手术组(均P<0.01)。见表2。3pvn抗剂的用量和模型建立的意义NPE是中枢神经系统损伤后的严重呼吸系统并发症,起病急骤,死亡率高。有研究显示下丘脑可能是NPE发生的重要部位。脑内组胺能神经元胞体主要集中分布于下丘脑结节乳头体核,其神经纤维广泛投射到各脑区,PVN有大量组胺能神经纤维投射,且该部位有组胺能受体分布。组胺能神经系统作为机体对危险反应的组织是在长期进化过程中保留下来的,中枢神经系统损伤对机体来说是一种非常危险的信号,必然会引起脑内组胺能神经系统的兴奋反应。而PVN既是重要的心血管活动中枢,也是下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴活动的直接控制部位。本实验通过向家兔小脑延髓池注射凝血酶和纤维蛋白原制作蛛网膜下腔出血后的NPE模型,发现发生NPE的动物PVN内组胺含量明显升高,提示NPE的发生与PVN的组胺含量变化之间存在一定关系。在PVN注射组胺H1、H2受体拮抗剂,发现H1受体拮抗剂可以减轻肺水肿的程度,降低肺水比,同时反映肺水肿液蛋白相对含量的A/P值下降,都说明肺血管的通透性下降;而H2受体拮抗剂则无明显作用。以往认为NPE是一种由于肺血管通透性增加的肺水肿,本实验结果表明给予PVNH1受体拮抗剂可以降低肺血管的通透性,但其机制有待进一步研究。Brown等的研究结果显示组胺对下丘脑很多神经元的兴奋是通过H1受体起作用的,本研究结果与之相符。因此,推测中枢神经系统损伤后,引起下丘脑结节乳头体核组胺能神经元兴奋,释放大量组胺,作用于PVN的H1受体,引起该部位神经元兴奋,继而引发肺水肿。但本研究也显示给予PVNH1受体拮抗剂只是能减少NPE的发生率和降低肺水肿程度,表明此途径可能不是引起NPE的惟一途径,因此NPE的中枢发病机制有待进一步研究。有研究表明,PVN神经元兴奋可以引起交感神经兴奋的表现,而且组织学和电生理学检查表明PVN小细胞神经元有直接长轴突投射纤维到达胸腰段脊髓中间外侧柱与交感节前神经元呈突触联系,也就为PVN能引起交感神经兴奋提供了形态和机能两方面的理论支持;第三脑室注射组胺可以使PVN部位的促肾上腺皮质素释放激素