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摘要豆枯草杆菌(Bacillussubtilislnatto)摘要豆枯草杆菌(Bacillussubtilislnatto)甲基红试验，乙酰甲基甲醇试验，枸橼酸利用试验，符合大肠杆菌性状 umbellatus umbellatus polysaccharideofGrifolaumbellatawerestudiedbyultrasonicextractionmethod.Theresultsshowthat,thebestsinglefactorconditionatthesolid-liquidratiowas1g:40mL,extractiontimeis60min,thetemperature60℃,ultrasonicpoweris100W,comparedwiththeconventionalwaterextraction,ultrasonicextractioncansignificantlyimprovethePolyporusumbellatuspolysaccharidecontent,shortentheextractiontime,reducetheratioofmaterialtoliquidandlowerextractiontemperature.PurificationofPolysaccharidebyethanol,ethanolpurificationconditionsofoptimalresultsshowthat,intheethanolvolumeratio4,precipitationof15hattheconcentrationof100%,thehighestpurificationefficiency.AccordingtotheanalysisoftheresultsofPolyporusumbellatuspolysaccharideinnature,Polyporusumbellatuspolysaccharidewithreducingpower,andareductionincreaseswiththeincreaseoftheconcentrationofpolysaccharide;TLCresultsshowed,Polyporusumbellatuspolysaccharideforpolysaccharide,iscomposedofapluralityoffructosyllinkedbyglycosidicbondpolymerization;PolyporuspolysaccharidehadastrongerinhibitoryeffectonSalmonellacoli,aStaphylococcusaureuscouldnotKeywords:grifola;Polysaccharides;Ultrasonicextraction;Purification;ofthe前 本课题研究的背景及意 本课题研究的内 纳豆激酶生物学特性 前 本课题研究的背景及意 本课题研究的内 纳豆激酶生物学特性 形态特征 理化性质 纳豆主要成分 纳豆激酶的提取方法 纳豆激酶的生物活 血栓溶 抗菌及提高免疫作用 降血压 降胆固 降血脂 抗氧化 纳豆激酶的研究进 纳豆激酶的应用前 2.1主要试剂的配 仪器设 2.2实验思 原始种子库的制备 主种子库的制 2.3小结 第三章纳豆激原始种子库的制备 主种子库的制 2.3小结 第三章纳豆激酶性质检 实验材料 3.1.1样品 3.1.2药品 主要试剂的配 仪器设备 菌种库检 平板划线 革兰氏染色镜检 抗生素抗性实 生化反应试 3.5小结 第四章结果与讨 4.1结论 4.2展望 22而平常用尿纳豆激酶(NarroKunase，NK)由食品纳豆中提取或纳豆菌发酵生产，是一种分子量远远小于UK、SK、tPA的蛋白质，并可由肠道，吸收，纳豆激酶的体外、体内溶栓性质通过实验也已得到确定，纳豆是日本的传统食品,已食用千年.但从197酶,同时纳豆激酶还具有很强的纤溶作用之后,纳豆及其酶制剂便引起普遍关注.很多学者对其进行了药理学和治疗或预防疾病的研究[1抗氧化等作用.与此同时一些食品生产和制造公司也对纳豆作了深加工.如日本的大和制药公司从纳1.1纳豆激酶的生物1.1纳豆激酶的生物学特1.1.1纳豆激酶的形态特枯草(纳豆)杆菌(BacillussubtilisNatto)发酵而成的日本传统食品。Sumi(1987)从纳豆中发现了一种具高效溶纤活性的酶——纳豆激酶(Nattokinase,NK),它是由枯草杆菌在纳豆发酵过程中产生的一种t-PA,从而表现出很强的溶血栓作用。此外,它还具半衰期长,无毒副作用,分子量小,可以口服,N07,其纳豆激酶酶活相当于1384.73U/mL尿激酶酶活。N07,pro-NK)381个氨基酸组成,在分泌过程中切除N端106个氨基酸残基而形成275个氨基酸的成熟分子，纳豆激酶等电点为8.6±0.3。1.1.2纳豆激酶的理化性1.2豆的主要成k21.2豆的主要成k2k21.3纳豆激酶的提取方法425％饱和度，低温过夜，4000rpm30min60％，低温过夜，4000rpm30minSuperdex75SPSepharoseFastFlow[8］，发现经硫析后，电泳可得到单一条带的纳豆蛋白产品，Mr27700。以上每一步都要进行酶的活性测定。测定方法为：纤维蛋白块溶解时间(CLT)1.6激酶的生物活1.6.1血栓溶1.6激酶的生物活1.6.1血栓溶纳豆激酶的一个显著功能便是具有溶解血栓的作用．MimuguF等人用血凝块溶解分析法涮定PlasminPlasmin4倍；1.6.2提高免疫400-1570-1110-144病原性大肠杆菌以及其它病原菌诸如，金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、李斯特菌1.6.3降血1.6.4降低胆固醇预防动脉硬动物实验证实，纳豆菌食品可以抑制血中的LDL氧化，有效降低总胆固醇以及三酸甘油酯的浓度，进而减少粥状动脉硬化的发生，纳对遗传性高血压的老鼠，对照组（大豆）血压逐渐升33.3Pa(250mmHg),合用纳豆的老鼠维持正常的 是因为纳豆菌食品中含有angiotensinconvertingenzyme(ACE)的inhibitor，它会阻止angiotensin变成activeform1.6.5防止骨质疏1.6.5防止骨质疏纳豆辅助补钙的机理是：骨质是由维生素K2和优质蛋白质先形成骨元蛋白，再与K2。大豆异黄酮能防止骨中钙的溶解，而维生K2则能够将钙固定于骨中。也就是说，大豆异黄酮和维生素K2的组合能相互协力，起到强骨的作用缓型减肥直观降低餐后血糖纳豆菌在肠内大约能坚持1周左右，可以促进其它有益菌增殖。肠内细菌，重量约为1公斤。当然它需要饵食供给。人体吸收的营养就成为肠内细菌的饵食而被吞噬，再加上纳豆激酶可燃烧脂肪,由此就能减肥。还有纳豆粘物质发挥了浸溶、包裹的作用。因而纳豆减肥是缓型有效的,不会反弹。然而餐后血糖值出现明显下降趋势，是非常直观的。一是纳豆菌吞噬葡萄糖和粘物质的作用,二是纳豆中的高弹性蛋白酶（或称胰肽酶E，Elastase）,抑制了血糖增加。它具有与猪胰脏所含的这种酶的作用，而猪胰腺的弹性蛋白酶已用于高血糖的治疗药物。解酒、保护肝脏纳豆酶进入人体后，通过三重渠道构建酒精防护屏障：进入人体肝脏系统，分解肝脏解酒压力，协助解酒；进入人体血管系统，在脑血管区域形成重点防护屏障，抵制酒精对大脑的抑制效应；进入人体消化道系统，迅速形成保护屏障，加速消化道酸性分泌，促进解酒。服用纳豆能迅速解决酒后不良反应，并能预防隔日醉。此外，纳豆中豆菌食品之所以具有这些功效，据推测应该是来自於其高含量的抗氧化成份。1.7纳豆激酶的国内1.7纳豆激酶的国内外研究进迄今为止,NakamuraNK基因Puc19质粒上,E.coliHB101受体菌中,该基因工程菌发酵产物具有胞外蛋研究还未见报道,但与纳豆激酶同源性很高的枯草杆菌蛋白E和枯草杆菌蛋白酶克隆amylosacchariticus(apr)基因,3种不同的枯草杆菌中(ISW1214,M1111,1A274),现转化菌株(ISW1214/PTH1)20倍4倍。MarkEPBS42上,转化枯草杆菌,表达的5倍。凌均建等[23]PBS1转导构E基因图谱。研究表明,克隆化的枯草杆菌蛋白酶基因只在静止生长期表达,并且受37启动子的控制。Talagi等[24]E基因克隆到嗜热2090年代开始,我国掀起了对纳豆激酶的研究和开发热潮,一的多种活性物质活化肝细胞，促进肝细胞再生，提高肝功能，保护肝脏，有效预防改善脂肪肝。所以在日本广为流行一个谚语：“喝酒时多吃纳豆防二日醉酒”有400多家工厂生产纳豆及纳豆激酶产品,供应国内外。目前认为日本大和制药有限公产品(453GMP2有400多家工厂生产纳豆及纳豆激酶产品,供应国内外。目前认为日本大和制药有限公产品(453GMP2酶产品,为复方制剂,产品名称为纳豆激酶(65美元/盒),作为食品补剂和功能食品在国溶解作用试验,具有明显效果,其研制的纳豆激酶制剂恩开胶囊已处于中试阶段纳豆激酶的基因工程菌,表达量可达40%以上,建立了用工程菌生产纳豆激酶的纯化工纳豆激酶菌种库的建立的研纳豆激酶（菌种2.1.22.1.3主要试剂的配2.1.4仪器设PH2.2目的以菌种验证实验中的最2.1.4仪器设PH2.2目的以菌种验证实验中的最佳单 3#，扩培制备原始种子库，通过原始种子库制备种子库，再通过主种子库制备工作种子库原始种子库制板培养基；配制LB液体培养基500ml，分装：50ml/250ml8瓶，LBAmp/IPTG//100ml/500ml2100ml/500ml2瓶。另准备洁净的50ml离心管（装液量5ml），30支1.5ml离心300支，试管15支，培养皿10个，121℃灭20min，备用2.3.2.制备原始种子库：过程:制备2瓶LB培养基各100ml，在平板上取表达最好的单LB1:1000AMP抗生素，放入摇床中600nmOD0.8~1.0时，停止20%）100支号，-20℃，保存主种子库的制备：以原始种子库菌种，扩培制备主种子库。（过程:制备2瓶LB度波长下测量吸光值OD0.8~1.0时，停止培养0.3ml的菌液，0.2ml波长下测量吸光值OD0.8~1.0时，停止培养0.3ml的菌液，0.2ml甘油接到准备好1001.5ml离心管中（20%）100支，编号，-20℃，保存）甘油浓度20%，数量100支，编号-20℃，保存2.6实验记一、配剂：培养基和设备名电子天设备编2011-4-24-名所需浓应实定厂批2.6实验记一、配剂：培养基和设备名电子天设备编2011-4-24-名所需浓应实定厂批培养琼备二、物料及器具灭超净台紫外灯开启时间 LB种子液体积： ml/ 瓶数：加入 体积： 添加比例： 再储存二、物料及器具灭超净台紫外灯开启时间 LB种子液体积： ml/ 瓶数：加入 体积： 添加比例： 再储存IPTG液 复核人 复核人 ： 操作时间：共计培养时间： ： 操作时间：共计培养时间： 菌液体积： 0.5ml/ 超净台紫外灯开启时间 LB种子液体积： ml/ 瓶数：加入 体积： 添加比例： 再储存摇床编号： 摇床设置温度： 摇床设置转速： 培养结束 ： 操作时间：共计培养时间： 菌液体积： 0.5ml/ 摇床编号： 摇床设置温度： 摇床设置转速： 培养结束 级菌种库之间的联系。（表达最佳单颗→原始种子库→主种子库→工作种子库样原始种子库（一级），主种子库（二级），工作种子库（三级级菌种库之间的联系。（表达最佳单颗→原始种子库→主种子库→工作种子库样原始种子库（一级），主种子库（二级），工作种子库（三级 ： 操作时间：共计培养时间： 菌液体积： 0.5ml/ 超净台紫外灯开启时间 LB种子液体积： ml/ 瓶数：加入 体积： 添加比例： 再储存摇床编号： 摇床设置温度： 摇床设置转速： 培养结束 3.1.2药结晶紫，碘液，95％乙醇3.1.2药结晶紫，碘液，95％乙醇，蕃红，香柏油，Tryptone,乳糖，0.04％溴甲紫，氯化钠，柯凡克试剂，K2HPO4.3H2O,葡萄糖，甲基红，萘酚乙醇试剂40%KOH,无水Mgso4，柠檬酸三纳，磷酸二氢铵，0.4%溴麝香草酚蓝3.1.3主要试剂的配2.1.4仪器设PH3.2种库的检原始种子库检2.1.LB琼脂平板：LB50-60Amp四、原始种子库检主种子库LB琼脂平板：LB50-60Amp至终浓度主种子库LB琼脂平板：LB50-60Amp至终浓度四、主种子库检超净台紫外灯开启时间 超净台编号 再储存 超净台紫外灯开启时间 超净台编号 接种后菌种处理方法：销毁□ 再储 工作种子库检LB琼脂平板：工作种子库检LB琼脂平板：LB50-60Amp至终浓度四、工作种子库检超净台紫外灯开启时间 超净台编号 再储存 革兰氏染色原理：革兰氏染色是1884年丹麦的医生发明的。其染色的原理是：①结养基、LB液体培养基（50ug/mlKana）、养基、LB液体培养基（50ug/mlKana）、LB液体培养基（50ug/mlAmp），37℃过夜培养。观察生长情况，应与原始菌种相符。（Amp产生AmpKana抗生素没有抗性，况下无法生长）LB液体培养基，37℃、200rpmOD6000.8~1.0超净台紫外灯开启时间 超净台编号：EQ-2010-超净台紫外灯开启时间 LB种子液体积： ml/ 加入 体积： 37 开始培养时间 次日0h3h1-1,1-2.3h2-1,2-1.3h1,3-2.沉淀用纯水复溶，（还原胶），15ulmark进行分子标记。分析其目的蛋白表达附件一图谱信息SDS-电泳图谱(还原超净台紫外灯开启时间： 超净台编号 加入1mM/mlIPTG体积： ul/0h3h1-1,1-2.3h2-1,2-1.3h1,3-2.沉淀用纯水复溶，（还原胶），15ulmark进行分子标记。分析其目的蛋白表达附件一图谱信息SDS-电泳图谱(还原超净台紫外灯开启时间： 超净台编号 加入1mM/mlIPTG体积： ul/ 添加比例 LB种子液接种体积：8 ml/瓶 6支50ml离心管 接种后菌种处理方法：销毁 摇床编号：ZHWY-211C- 摇床设置温度： 开始培养时间 结束培养时间：孔 34567892为低分子量marker,从上自下分97400道尔顿、66200道尔顿、43000道尔顿、31000道尔顿、20100道尔顿、14400道尔结果分析：经过诱导后目孔 34567892为低分子量marker,从上自下分97400道尔顿、66200道尔顿、43000道尔顿、31000道尔顿、20100道尔顿、14400道尔结果分析：经过诱导后目的蛋白表达含量平均在35%左右，不低于原始菌种的表达量2.5.生化反应：乳糖发酵试验，靛基质试验，甲基红实验，乙酰甲基甲醇生成实验，枸酸盐利用试验，应符合大肠杆菌生物学性状如培养基变红色或黄色，产气（小导管管内有气泡，气泡无论大小）。为避孔序123456789名/M1-1-2-2-3-3-/处//0ul还min离0ul还min离0ul还min离0ul还min离0ul还min离0ul还min离0ul还min离/上样//目的白纯////的细菌，可于24h出现阳性，或适当延长培养时间。5.生化实的细菌，可于24h出现阳性，或适当延长培养时间。5.生化实5.1.乳糖发酵试氯化钠2、培养：37℃,24h，4ml\支试管3（空白对照，（1#2#（3#4#244h为黄色，说明纳豆激酶在乳糖发酵试验出现了阳性。1、培养基的配制：tryptone1.4g；H2HPO4.3H2O0.8Gg；1.0g200ml，1#~9#B48ha1ml40l，充分h内出现红色应判为阳性，无红色反应为阴性。3LB（1#~2#）， 作种子（7#~9#）后，培48h，接a1m400.4ml。在4h内出现红色，说明纳豆激酶在乙酰甲基甲醇生成试验中呈现阳性。第四果与讨4.1结第四果与讨4.1结4.2展科学研究表明,纳豆激酶能够有效的清除人体血液内的血栓对高血压,衰老,中风,肌痉挛和心脑血管疾病也有很好的疗效。而血栓疾病是严重危害类健康的主要疾病之一,如急性心肌梗塞等全世界现有血栓塞用的及一些还在开发的治疗心脑血管栓塞疾病的药品,如链激(SKUkPA甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶激活剂复合物(APSAC)、尿激(proUK)等,均在不同程度上存在一定的缺陷,或者毒性比较强作用比较大;或在体内半衰期比较短,药效难以发挥;或来源紧缺价格昂贵,很难成为一种大众药品,因此口服性溶血栓药物的开是当前研究的热点由于纳豆激酶的特殊溶栓作用,再加上它成低,来源于日本传统的食物,安全性好,低,来源于日本传统的食物,安全性好,同是一种分子量远的蛋白质,并可由肠道吸收,在体内作用持续间长,最重要的一点是它还能激活人体RtPA,使之温和、持续提高血液的纤溶活性,因而将纳豆激酶用于开发新一代的溶栓或保健食品,具有极为诱人的广阔前景我国对于纳豆激酶的研究还刚刚起步，需要借鉴和学习的地方有很多，随着医学的的进步和人类需要，相信对纳豆激酶研究更加的深刻，纳豆激酶也会在未来的医学上发挥其重要的价值为人类带来福音201552DatarRV,CartwrightT,RosenCG.[J].Biotechnology,1993,11(3):349.[2]FujtaM,HongK,IroY.].BiologicalandPharmaceuticalBulletin,1995,18(9):1194-[3]MitsyguF,KyongsuH.ThrombolyticEffectofNattokinaseona