还元煎对机体生理平衡的影响

还元煎对机体生理平衡的影响

1系统协调的必要性整体观是中医学理论体系的两个基本特征之一，也是本研究的指导原则。中医学除重视人与自然的统一性与完整性以外,尤其强调的是人体自身各个部分的统一性与完整性。中医学认为人体是一个有机的整体,构成人体的各个组成部分不仅仅在结构上是不可分割的,在其生理功能方面也是相互依存、相互制约和相互为用的协调平衡的一个整体。人体的正常生理活动,一方面要依靠各个脏腑组织充分发挥其各自的正常功能,另一方面要依靠各种生理活动之间的相互协调,才能维持正常的生理平衡。运动训练过程中疲劳的发生,归根结底是由于正常的生理平衡状态的紊乱。任何消除疲劳手段的实施,其最终目标也都是为了纠正这种生理平衡的紊乱,使其达到新的平衡,达到消除疲劳、加速运动能力提高的目的。近10余年来,随着分子生物学手段的介入,以及神经内分泌学和免疫学研究的深入与发展,人们对它们的认识不断加深与扩大。越来越多的事实证明,在完整机体存在着一个神经系统、内分泌系统和免疫系统相互之间互为联系、互为影响、互为因果的“神经内分泌免疫网络”,并由这个网络系统调控机体的内环境,最终维持机体正常的生理平衡。本研究就是以该网络内各个不同的环节为具体线索,试图从不同层次和不同角度,观察“还元煎”对机体的生理平衡具有何种调节作用,从而深入地阐明“还元煎”在消除疲劳、加速恢复及提高机体运动能力方面的作用机理。2材料和方法2.1实验材料2.1.1患者、药品和颗粒刀豆蛋白(ConA),Sigma公司;脂多糖(LPS),第二军医大学微生物教研室提供;RP-MI1640培养基,GIBCO公司;β-内啡肽(β-EP),精氨酸加压素(AVP),缩宫素(OT)和强啡肽A1-13(DynA1-13),美国Peninsula实验室产品;β内啡肽,精氨酸加压素,缩宫素及强啡肽A1-13抗血清,第二军医大学神经生物学教研室制备;Na125I,英国Amershan公司;氯胺T,Sigma公司;抑肽酶,Sigma公司;3H-甲基胸腺密啶脱氧核苷(3H-TdR),由中科院上海原子核研究所提供;地塞米松,Sigma产品;1,2,4-3H-Dex,英国放化中心产品;淋巴细胞分离液,上海试剂二厂。“还元煎”:由麦冬、锁阳等五味中药(由上海市蔡同德药号供应)组成,常规煎制。2.1.2实验动物由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供成年雄性健康大鼠。2.1.3细胞收集器和液体基本计数仪超净工作台:吴江净化设备厂产品;二氧化碳培养箱:德国贺利氏公司产品;多头细胞收集器:上海跃进医疗设备仪器厂产品;液体闪烁计数仪:LKB公司产品;1275型γ-计数器:LKB公司产品。2.2实验方法2.2.1流动水采用二级水势梯度沉淀法ws的大鼠养殖将大鼠在动物室适应性喂养1周,按体重分层随机分为四组:安静对照组(C),安静中药组(M),训练组(T),训练加中药组(T+M),每组均12只,然后开始训练和给药。期间每周称体重1次。训练采用游泳的方式,大鼠在自制的流动水游泳池中训练。游泳池45～50cm,水温30℃±1℃,通过水流落差改变水流速度,大鼠克服水流阻力游泳。训练开始首先对大鼠进行适应性训练,并获取大鼠力歇负荷训练指标,以大鼠协调运动消失,没入水中10s尚不能返回水面为大鼠力竭。在池面水流速度为1.4m/s时,大鼠平均力竭时间为40min,然后取其80%为开始训练量,即30min/次开始训练。每周训练6天并逐渐递增训练时间和强度(表1)。给药与训练同步进行,采用经口灌胃方式灌约(上午7:00-8:00,下午18:00-19:00),每次1.5ml,每日2次服药,剂量相当于成年人每公斤体重剂量的20倍,每周给药6天,喂药至实验结束。不给药大鼠,同时灌服等量生理盐水。2.2.2动物死亡于第6周最末一次训练和给药后第2天上午,安静状态下将大鼠迅速断头处死。各组交叉进行。2.2.3两组细胞水平的比较无菌取脾,置100目不锈钢钢网上,10ml注射器芯轻压脾脏用1640液冲洗钢网,淋巴细胞分离液常规分离淋巴细胞,Hanks液1000g×10min离心,重复洗2次,悬浮于RPMI-1640完全培养液中,调节细胞浓度至1×107/ml,加入96孔平底细胞培养板,每孔0.1ml,同时加含ConA10μg/ml或LPS5μg/ml的培养液0.1ml,对照孔以完全培养液补足,每组均设实验与对照组各3孔,即设ConA组,LPS组及对照组共9孔,每孔反应总体积为0.2ml。置37℃,5%CO2中培养48h后,每孔加入luci的3H-TdR,继续培养8h,培养结束后用多头细胞收集仪收集细胞,用LKB液闪计数仪测cpm值。2.2.4检测大鼠血浆神经肽含量(1)开颅,剥离脑组织及垂体,立即投入100℃的生理盐水中煮5min,捞出,分离下丘脑、垂体,投入匀浆管,加入1NNaOH溶液1ml,混匀,室温静置100min,加入1NHCl溶液1ml,离心后取上清,贮于-40℃冰箱保存待测。(2)血标本制备。动物断头后,将血收集于加有抑肽酶(500U/ml血)和抗凝剂Na2-EDTA的预冷塑料管内,混匀、离心后取血浆贮环境-40℃冰箱内待测。(3)放射免疫测定下丘脑、垂体和血浆神经肽。其中,下丘脑及垂体提取液的RIA用饱和加样法,每管加标准品液100ul(1-1024pg)或提取液的50ul,稀释的抗血清100ul和标记物100ul(8000-10000cpm)缓冲液加至500ul,4℃下孵育24h。血液的RIA用顺序饱和加样法,每管加标准品100ul(1-1024pg)或血浆300ul,稀释的抗血清100ul,缓冲液加至500ul,4℃下孵育24h再加入标记物100ul(6000-8000cpm),继续孵育24～48h。孵育期满,每管加入300ul或400ul(2%)加膜活性炭,混匀,离心弃上清,沉淀物用γ计数器计数,计算并绘制竞争抑制曲线,同时用Lowry改良法测定下丘脑及垂体组织液蛋白质浓度,最后换算成各样品的神经肽含量。另外,胸腺细胞糖皮质激素受体测定,按我们以前报告的方法,采用放射配体结合分析法测定。大鼠皮质酮浓度测定,采用竞争性蛋白结合分析法。血红蛋白浓度测定,采用氰化高铁血红蛋白法。3结果3.1在运动训练和“还原煎”大鼠的一般情况下3.1.1各组大鼠体重增长情况同安静对照组相比,训练组大鼠体重增长缓慢,训练加“还元煎”(T+M)组大鼠体重增长较慢,但高于T组大鼠,M组大鼠体重增长情况与C组大鼠接近(表2)。3.1.2非训练因素与死亡同其它三组大鼠比较,T组大鼠较多出现萎蘼不振,反应迟钝,毛发稀疏等表现;各组因非训练因素与死亡共6只。此外,在游泳训练后期,T组大鼠力竭溺死2只,T+M组力竭溺死1只。3.1：3饮食量的改变与C组比较,T组大鼠饮食量明显减少,接近负性增长。而T+M组与M组大鼠在实验前后饮食量增长超过C组(表3)。3.1.4种常用组和两种方法除去意外死亡的大鼠,各组数目为C组12只,T组10只,M组10只,T+M组7只。在游泳训练第6周,T组大鼠有2只不能完成训练任务,运动能力下降,T+M组基本能完成任务。3.2t+m组血清t+m组蛋白表达水平同C组比较,T组血红蛋白明显下降,统计学处理有显著意义(P<0.01);而T+M组,无明显下降。同C组比较,T组白细胞数明显上升,其它各组之间比较未见显著差异(表4)。3.3运动训练和“还原煎剂”对大鼠脾淋巴结肿胀的影响3.3.1明显下降p>0.0.1与C组比较,T组大鼠脾细胞对ConA增殖反应明显下降(P<0.01);而T+M组的大鼠脾细胞对ConA增殖反应能力与C组相比,未见显著差异;M组与C组比较也无显著差异(表5)。3.3.2t+m组大鼠脾细胞对lps增殖反应能力的比较与C组比较,T组大鼠脾细胞对LPS增殖反应明显下降,统计学上有非常显著意义;而T+M组大鼠脾细胞对LPS增殖反应能力与C组比较也有下降,但较T组有增高趋势;M组与C组比较未见显著差异(表6)。3.4训练和“还原”对大鼠脑出血、垂体和血浆神经遗传因素的影响3.4.1t+m组-ep含量的变化与C组比较,T组β-EP含量在下丘脑和血浆水平明显升高,统计学上有显著意义。在垂体水平有下降趋势,但统计学上不明显。T+M组β-EP含量在下丘脑、垂体和血浆水平均与C组接近,未见显著改变。M组与C组比较,β-EP在三个水平均无显著性差异(表7)。3.4.2dyna1-13在血浆水平的测定与C组比较,T组DynA1-13在下丘脑和垂体水平明显升高(P<0.01),但在血浆水平未见显著性差异;T+M组DynA1-13在下丘脑、垂体和血浆水平上均与C组接近,未见显著性差异;M组与C组比较,DynA1-13在三个水平上均未见显著性差异(表8)。3.4.3t+m组大鼠血浆和外周血vep含量的比较与C组比较,T组AVP含量在下丘脑、垂体和血浆水平呈不同步性改变,其中下丘脑和血浆AVP含量升高,垂体水平AVP明显减少;T+M组AVP在下丘脑、垂体和血浆水平与C组比较均未见差异;M组与C组比较,AVP含量在三个水平上均未有差异(表9)。3.4.4各组t、b组的ot含量和体外水平的比较与AVP和β-EP的改变相似,与C组比较,T组OT含量在下丘脑和血浆水平均明显升高,垂体水平有下降趋势,但统计学上改变不明显;T+M组OT水平与C组接近;M组与C组比较未见显著性差异(表10)。3.4.5各组血浆gc、gc浓度的比较与C组比较,T组胸腺细胞GR位点数明显减少,统计学上有显著意义;T+M组GR水平较C组减少,但较T组提高,统计学上均无意义;M组与C组比较无差异(表11)。(2)对血浆GC浓度的影响与C组比较,T组血浆GC明显升高有显著差异;T+M组血浆GC尽管较C组为高,但统计学上无意义;M组与C组比较无差异(表11)。4讨论4.1神经内脏功能大量工作业已证明,运动疲劳时机体免疫功能(包括T细胞和B细胞免疫功能)常有不同程度的改变。多年来,人们一直致力于研究如何通过中药手段来对抗疲劳所致的免疫力低下。本研究观察到经过为期6周的递增负荷游泳训练,造成大鼠脾脏淋巴细胞对ConA和LPS的增殖反应低下。应用以调通心肾为原理的中药“还元煎”后,淋巴细胞的增殖反应能力都有一定程度的上调作用,尤其对ConA增殖反应的上调作用更为明显。已有研究表明,神经内分泌系统可以通过不同环节和途径调制机体免疫机能。按Besedovsky提出的神经内分泌和免疫网络学说来解释,疲劳时免疫机能的失调和下降,主要是由于神经内分泌机能的紊乱。我们前期的工作也证明,运动疲劳时淋巴细胞表型变化与血浆应激激素水平提高有密切关系,推测本研究所示训练后淋巴细胞增殖反应能力下降与神经内分泌功能改变有其内在的联系。“还元煎”的组方,注重全身机能的调整,其对免疫机能的调整很可能是通过对神经内分泌系统的调节而达到的(见以下讨论)。4.2对内源性阿片肽对免疫功能的影响下丘脑公认是机体的神经内分泌免疫网络中枢,它对免疫功能的调节主要是通过调控各种神经肽和激素的分泌,及改变免疫细胞上相应受体的信息传递来实现的。在证实了“还元煎”对运动疲劳大鼠免疫功能具有一定调节作用的基础上,为了深入探讨这种作用的可能机理,我们又研究了6周高强度大运动量训练后,主要由下丘脑或(和)垂体分泌的几种神经肽β-EP、AVP、OT、DynA1-13在下丘脑、垂体和血浆中含量的变化特征,同时观察了“还元煎”的应用对这些变化的影响。β-EP和DynA1-13都属于内源性阿片肽,它们的主要作用是协调和统一应激时全身各系统的机能,同时它们也是体内重要的免疫调节因子。一般认为,在完整机体,内源性阿片肽对机体免疫功能是抑制的,比如说,β-EP能抑制淋巴细胞上IL-2受体与IL-2的结合,也能抑制B细胞的抗体形成,运动训练后CD4/CD8比值的改变也与血浆中β-EP浓度升高有相关关系。分析我们的实验结果,6周强化训练后β-EP含量在下丘脑和血浆水平异常升高,但在垂体水平却明显减少;DynA1-13含量在下丘脑和垂体水平显著升高,但血浆水平却未见明显改变。β-EP和DynA1-13在下丘脑、垂体和血浆水平出现的这种不同步变化,提示由于过度训练造成这些内源性阿片肽在其合成、贮存、运输和释放等环节之间出现了不协调。进一步分析结果,发现在同一大鼠体内,β-EP含量越高,脾细胞增殖反应能力越低下,β-EP和脾细胞增殖反应呈负相关关系。这强烈提示,大鼠体内β-EP的上升是导致免疫功能抑制的重要原因,当然关于其作用途径和机制尚需进一步探讨。在观察运动训练对下丘脑、垂体和血浆β-EP和DynA1-13含量影响的同时,也观察了训练结合应用“还元煎”对这些变化的影响。发现训练结合应用“还元煎”组6周训练后,不仅血浆β-EP、DynA1-13水平明显低于单纯训练组,基本维持在正常水平,而且下丘脑、垂体水平β-EP和DynA1-13也基本接近对照组水平。结合上述关于内源性阿片肽与免疫功能之间关系的讨论,我们有理由认为,“还元煎”对下丘脑、垂体和血浆水平内源性阿片肽的调节,是该方药改善机体免疫功能的一个重要机制。AVP是在下丘脑室旁核和视上核的巨细胞神经元中合成的经典激素。近年来的研究认为,AVP作为神经内分泌免疫网络中的一分子,也参与了机体免疫活动的调节过程。AVP可为淋巴细胞诱生γ-干扰素提供辅助信号,并且这种作用与淋巴细胞的AVP受体功能有关。本实验观察到大鼠在接受6周强化训练后,下丘脑、垂体和血浆AVP含量与正常对照组比较呈现不同程度的紊乱。喂服“还元煎”训练的大鼠、下丘脑和血浆升高的AVP水平和垂体降低的AVP浓度都趋于正常,说明“还元煎”对AVP含量具有明显的双向调节作用。近年来,解剖学和生理学的实验工作均已证明AVP具有CRH样作用。从解剖学角度讲,AVP与CRH共同来源于下丘脑室旁核内侧的小细胞;从生理功能方面看来,AVP也具有CRH样作用,并且还可通过加强CRH作用,促进ACTH的释放。鉴于CRH-ACTH-GC系统在机体应激过程中对免疫功能的调节,以及在维持内环境稳定方面的重要地位,可以相信,“还元煎”对训练大鼠免疫功能调制作用,很大程度上是通过调节AVP系统进而影响下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的功能来实现的。OT也存在于下丘脑小细胞神经元中,并可向孤束核、蓝班以及脊髓投射。解剖学发现,在大鼠室旁核细胞中OT与CRH也有共存。体外研究表明,OT也可促进垂体前叶细胞释放ACTH;体内研究也证实,OT可增加CRH介导的ACTH分泌,并且发现,对OT被动免疫中和后可降低ACTH对应激的反应。6周强化训练后,大鼠下丘脑、垂体和血浆OT改变与AVP的变化趋势相似。即下丘脑、血浆水平升高,垂体水平降低。OT合成、分泌与释放功能的紊乱,可能直接或间接地通过CRH-ACTH-GC系统参与训练后机体的免疫抑制。结合喂服“还元煎”训练组大鼠,体内OT浓度基本接近正常水平,提示“还元煎”增强机体免疫功能的作用,与其改善大鼠体内OT含量之间必然有着密切的内在联系。4.3肌肉gc和gr对机体免疫调节的作用皮质酮是大鼠主要的糖皮质激素,公认是体内重要的免疫抑制因子,它能明显抑制T细胞对有丝分裂原刺激的增殖反应和自然杀伤细胞活性。一般认为,GC的作用必须通过与靶细胞上的GR结合才能发挥。众所周知,胸腺是中枢免疫器官,是外周T细胞的发源地,因此,胸腺细胞又不同于一般靶细胞,它的GR是神经内分泌系统向免疫系统传递信息的重要环节。动物经6周强化训练后,其血浆GC水平显著升高,胸腺GR位点数减少,该结果与我们以前的工作是一致的。尽管血浆GC明显升高,但由于GR减少,从而使机体在应激中,包括当受到细菌、病毒等致病因子侵袭时,血浆中GC的反应能力减弱,削弱了机体神经内分泌系统的直接调控作用和对机体各系统潜在能力的调动作用。同时,由于胸腺淋巴细胞GR位点数的减少,使机体对致病因子的反应不能迅速及时传递到免疫系统,导致机体抵御致病因子的能力明显减弱,这可能是大运动量运动训练期间,机体抵抗力下降,易患各种感染性疾病的一个重要原因。本研究结果表明,应用“还元煎”训练的大鼠,其血浆GC含量明显低于单纯训练组大鼠,并且GR下降较单纯训练组明显减轻。我们认为,这种改变对增强机体抵抗力,维持内环境稳定具有十分重要的意义。不仅如此,对胸腺GR的调节,也加强了机体应激过程中神经内分泌系统和免疫系统之间的信息沟通;当然,更重要的是加强了整个网络的协调和整合功能。4.4阴阳平衡、以养神为本,通心肾阴阳学说是我国古代的哲学思想。“万物负阴而抱阳,冲气以为和”(《老子:道德经》)。“和”所以能生物是阴阳对立的双方合而为一,成为统一协调的整体,从而在更高层次上体现新的质。宇宙的生命起源以及人类的一切生命活动都受到阴阳对立统一法则的支配。如“凡阴阳之要,阳秘乃固,两者不和,若春无秋,若冬无夏,因而和之,是为圣度,故阳不能秘,阴气乃绝,阴平阳秘,精神乃治,阴阳离决,精气乃绝”。训练过程中疲劳的发生,从根本上来说,就是机体的阴阳之间失去相对的协调平衡能力。如能“把握阴阳,呼吸精气,独立守神,肌肉若一”,即可保持内环境的统一并维持运动能力长久不衰。中医经典认为心肾不交,水火不济,是造成阴阳失衡的主要原因,“肾属水脏,封蛰之官,藏精”,“心属火脏,性炎上,君主之官,藏神,生血,主血脉”,“心者生之本,神之变也,肾者主蛰藏之本,精之处也,夫神精之用,为人身之大主,精以养神,神藏于精,而气行乎于其间,惟其有以居之,有以藏之,而人道以立此,心肾为人之大主也”,“心火必须下降于肾为和,肾水必须上承于心为顺”所谓“君火之下,阴精承之”。只有心肾相交,互相为用,生理功能才能正常,反之心火不能下降于肾,独亢于上,神失所养,浮越以外,为无根之神,肾水不能上承于心而凝聚为无化之水。因此心肾不交,机体生理平稳就会遭到破坏,即“亢则害”。从医学观点来看,所谓阴阳平衡,可理解为人体内环境的稳定,这种稳定主要依靠神经内分泌免疫网络的调控。一般来说,西药的作用是单方面的,如降压药不会升压,升压药也不会有降压作用。但中医的许多药方则具有双向调节作用,使不正常的生理功能(阴阳失衡)朝着正常的方面发展,如亢者降低,低者上升,达到阴平阳秘,互相