铜绿假单胞菌对7种抗生素的联合抗菌效应

铜绿假单胞菌对7种抗生素的联合抗菌效应

铜绿假单胞菌（pae）是庭院感染的主要病原体之一。在中国重症监护病房分离的革兰阴性菌中,铜绿假单胞菌位列第一。由于具有天然和获得性耐药,铜绿假单胞菌对很多抗菌药物耐药,给临床治疗带来很大困难。β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类抗菌药物是临床治疗Pae感染的常用药,近年来随着新的耐药基因的不断出现,Pae对这三类抗菌药物的耐药性普遍增加,甚至出现多药耐药(MDR)和泛耐药(PDR)菌株。多黏菌素类对革兰阴性菌尤其是铜绿假单胞菌有强大抗菌作用,多黏菌素具有表面活性,含有带阳性电荷的游离氨基,能与革兰阴性杆菌细胞膜磷脂中带阴性电荷的磷酸根结合,破坏细胞膜的渗透完整性,使膜通透性增加,胞内重要营养物质外漏导致细菌死亡,国外有关Pae对多黏菌素B敏感性的报道较多,但在中国较少见到这方面的报道,可能与多数医院考虑到其毒性而慎用有关。为准确了解Pae对上述几种抗生素的药敏情况,我们随机挑取临床分离的60株Pae,其中30株分离自住院病例,30株分离自门诊病例,采用琼脂稀释法进行多黏菌素B及其它6种药物的药敏试验,为临床正确治疗Pae感染提供实验室依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1临床标本的质控60株铜绿假单胞菌均来自广州医学院第一附属医院的临床标本,其中30株分离自住院病例,30株分离自门诊病例,经VITEK2细菌自动鉴定系统鉴定,质控菌株为ATCC27853、ATCC25922。1.1.2药物、药品和抗菌药物产品Muller-Hintom(MH)琼脂由杭州天和微生物试剂有限公司提供,庆大霉素(Gen,Sigma公司,批号G3632),多黏菌素B(polymyxinB,Sigma公司,批号P4119),妥布霉素(Tob,Sigma公司,批号T4014),阿米卡星(AMK,Sigma公司,批号A3650),亚胺培南(IMP,Sigma公司,批号I0160),奈替米星(Net,Alexis公司,批号380048),环丙沙星(CIP,中国药品生物制品检定所,批号130451-200302)。7种抗生素均在有效期内使用。1.1.3质量控制和评估标准用铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希菌ATCC25922对所有抗菌药物进行药敏试验,结果判断参照2008年CLSI标准。1.2方法1.2.1菌液ph测定从已经分纯并过夜培养的细菌平板上挑取4～5个菌落,接种于0.9%生理盐水中,菌液以比浊仪校正浊度至0.5MacFarland,再用生理盐水稀释至107cfu/ml。1.2.2制备专用于抗菌药物的溶液见表1。1.2.3抗菌药物的联合药敏试验将7种抗菌药物分别用灭菌的相应稀释剂倍比稀释成12个浓度,依次为2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25μg/ml。将稀释好的不同浓度的抗菌药物分别再与灭菌的MH琼脂液以1:9的比例配制成含药琼脂平板。做联合药敏时,将配好的不同浓度的两种抗菌药物按棋盘稀释法设计,两两组合。观察结果,记录单药应用时的各药最低抑菌浓度(MIC)及两药联合时的MIC,并选择最佳组合效应时两药联合时各自的MIC,计算FIC指数。FIC指数计算与判读标准为:FIC指数(A+B)=(A药联合时的MIC/A药单测时的MIC+B药联合时的MIC/B药单测时的MIC),FIC指数≤0.5为协同作用,0.5<FIC≤1为相加作用,1<FIC≤2为无关作用,FIC>2为拮抗作用。1.2.4种药物对pae抗菌活性的影响(1)根据琼脂稀释法测得每株菌对7种药物的MIC,计算50%抑菌浓度(MIC50)、90%抑菌浓度(MIC90)、MIC几何均数(MICG)、耐药率(%)、敏感率(%)等,比较体外药敏试验中的7种药物对Pae抗菌活性。(2)两组完全随机化设计资料均数的t检验:随机抽取的60株铜绿假单胞菌(30株分离于住院病例,30株分离于门诊病例),分成两组:住院病例组和门诊病例组,通过计算两组MICG,分别对单药药敏的MIC做t检验,测定7种药物对不同标本来源菌株的t′值,t′0.05=2.045,t′P>2.045,则P<0.05,差别有统计学意义,反之,P>0.05,差别无意义,从而比较抗菌药物对住院病例组和门诊病例组抗菌活性差异有无显著性。(3)通过计算FIC指数,测得多黏菌素B与其它6种药物有无协同或相加作用(FIC指数≤0.5为协同作用,0.5<FIC≤1为相加作用)。2结果2.17抗菌药物的耐药情况通过琼脂稀释法测定7种药物对60株Pae抑菌浓度,计算MIC50、MIC90、MICG、耐药率、敏感率。结果见表2。从表2可以看出,目前临床分离的Pae对多种抗菌药物都表现出很高的耐药性,耐药率由高至低依次为Net68.3%、Tob65%、Gen60%、CIP46.7%、IMP40%、Amk13.3%,可以发现这些临床分离菌株对普遍公认的有效抗Pae的抗生素IMP的耐药率也达到40%,并且出现了对包括β-内酰胺类、氨基糖苷类、奎诺酮类等多种抗生素全部耐药的泛耐药菌株(本试验检出19株,占总试验菌株的31.7%)。另外,实验显示,polymyxinB的敏感率为100%,甚至对MDR、PDR菌株也同样具有很好的抗菌作用。2.2耐药率及耐药率通过对临床筛选的60株铜绿假单胞菌药敏检测,其多重耐药和泛耐药现象十分严重,耐药率分别为55%(33/60)和31.7%(19/60)。其中多重耐药菌株中,对β-内酰胺类和氨基糖苷类共同耐药的有19株,对氨基糖苷类和氟喹诺酮类共同耐药的有29株。2.37micg的比对7种抗菌药物对30株住院病例标本和30株门诊病例标本抗菌效应差异性,用t检验分析所得几何均数,结果见表3。结果显示,门诊病例菌株的MICG大多明显低于住院病例菌株。通过统计学方法分析发现,这种差异在Gen、Net和Tob有统计学意义,检验结果P值分别是<0.01、<0.01和<0.05,在Amk、polymyxinB、CIP和IMP,差异无显著性(P>0.05)。2.4细胞培南联合多黏菌素b和奈替米星联合的mic酶学特性多黏菌素B与6种抗菌药物单用和联合应用的MIC50、MIC90、MICG,结果见表4,从表4中可以看出,多黏菌素B与环丙沙星、亚氨培南联合、多黏菌素B与奈替米星联合,能明显降低彼此的MICG。2.5b药的mic/b药协同作用说通过计算FIC指数,观察polymyxinB与6种抗菌药物的联合应用效果:FIC指数(A+B)=(A药联合时的MIC/A药单测时的MIC+B药联合时的MIC/B药单测时的MIC),FIC指数≤0.5为协同作用,0.5<FIC≤1为相加作用,1<FIC≤2为无关作用,FIC>2为拮抗作用,具体见表5。从表5中可以看出,多黏菌素B与环丙沙星、亚氨培南有明显联合抗菌效应。3抗菌药物联合应用本实验涉及的60株Pae均为广州医学院第一附属医院检验科07、08年间的临床分离菌株,实验结果显示,这些菌株大多对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类抗生素表现出多重耐药现象,60株Pae对各种抗菌药物的耐药率依次为:Net(68.3%)、Tob(65%)、Gen(60%)、CIP(46.7%)、IMP(40%)、Amk(13.3%)、polymyxinB(0),除多粘菌素B外,这些菌株对临床抗Pae感染常用的三大类抗生素β-内酰胺类、氨基糖苷类和喹诺酮类,都有一定的耐药率。多黏菌素具有表面活性,含有带阳性电荷的游离氨基,能与革兰阴性杆菌细胞膜磷脂中带阴性电荷的磷酸根结合,破坏细胞膜的渗透完整性,使膜通透性增加,胞内重要营养物质外漏导致细菌死亡,多黏菌素类对革兰阴性菌尤其是铜绿假单胞菌有强大抗菌作用,这与蔡心安、楼非鸿等人报道相似,这给以后的Pae感染治疗提供了借鉴和可能途径。从表2可以看出,polymyxinB对Pae的敏感率为100%,所以对难治性Pae感染,特别是多重耐药Pae,可以考虑使用多黏菌素,考虑不同的给药方式,以减少不良反应。Pae是常见的医院内获得性感染条件致病菌,同时对多种抗菌药物具有耐药性。难治性Pae感染疾病的治疗,是当前抗菌药物化疗领域的重要课题之一。对于严重全身感染、免疫功能低下合并感染、混合性细菌感染、机会感染、耐药菌株感染,一般单一用药往往不能获得很好的疗效,采用抗菌药物联合治疗这些感染往往有一定效果,而临床用药方案的制定,常需参考体外联合药敏试验,部分抑菌指数(FIC)是评价抗菌药物联合效应的重要参数。临床联合应用体外药敏试验呈协同或相加作用的抗菌药物治疗Pae感染,可望得到较高的临床治愈率,并且可以有效减少用药量,防止或避免不良反应和毒性反应的发生。分析表4、5,polymyxinB+CIP组合和polymyxinB+IMP组合,有明显的协同或相加作用,协同率分别是46.7%和40%,两两联合之后,MIC50、MIC90、MICG分别有所下降,尤其是MICG下降最为明显,说明联合用药可以明显增加彼此的抗菌活性,使用药量减少,从而有利于减少或避免毒性反应。polymyxinB+Amk、polymyxinB+Tob组合,联用比单药polymyxinBMIC50、MIC90升高,MICG总体趋势是升高,Amk和Tob的MIC50、MIC90基本保持不变,而MICG升高,说明这两组药物联用是拮抗作用,提示在临床用药过程中要避免这样的联合应用,以免因剂量的增加而增加毒性作用。polymyxinB+Gen、polymyxinB+Net组合,MIC50、MIC90和MICG有不同程度的降低,提示这两组组合虽无明显协同作用,但联合应用可能降低总体用药量,其机制还有待进一步研究,临床用药可参考借鉴。通过对60株不同标本来源的菌株MICG分析发现(见表3),住院病例标本与门诊病例标本菌株MICG有明显不同,用统计学方法分析,其中Gen、Tob和NetP<0.05,提示有显著性差异。Amk、polymyxinB、CIP、IMPP>0.05,差异虽无统计学意义,但可明显看出,门诊病例标本菌株的MICG都明显低于住院病例标本,这提示住院病人感染Pae的耐药性更严重,可能与住院病例标本大部分来自于重症病人有关。铜绿假单胞菌对抗生素的耐药性呈逐年上升趋势,给临床用药造成巨大的威胁。因此,根据体外药敏试验选择合适的抗生素,是临床医生使用抗生素应遵循的原则,也是防止和延缓细菌耐药的重要措施。本次试验研究表明,polymyxinB有很强的抗Pae作用,单