臂旁内侧核向感觉传递的顺行追踪技术

臂旁内侧核向感觉传递的顺行追踪技术

臂侧核（pbn）是围绕着小脑足部周围的神经组成的，可分为三个部分：臂侧核（pbl）、臂侧核（pbm）和kf核。PBN的功能非常复杂,主要与呼吸调节、心血管活动和味觉等内脏活动和感觉信息的传导有关。PBN具有广泛的纤维联系,Saper在最近的一篇综述中对其进行了系统总结,指出PBN向丘脑发出投射的神经元仅位于PBL的内外侧亚核(internallateralsubnucleus,IL),且IL也仅向丘脑板内核群投射。丘脑内接受躯体感觉信息(包括伤害性信息)的特异性核团主要是丘脑腹后内侧核(VPM)和丘脑腹后外侧核(VPL),此二核合称丘脑腹基底复合体(VBC)。三叉神经脊束核尾侧亚核(Vc)和脊髓背角浅层是躯体伤害性刺激信息传递的初级门户。近年的研究证实PBN也是Vc和脊髓背角浅层上行投射神经元的重要中继站,在躯体伤害性刺激信息向高级中枢传递过程中发挥重要作用。由于观察PBN是否向VPM投射对深入阐明面口部伤害性刺激信息的传递和调控有重要的意义,故本研究用四甲基罗达明(TMR)或辣根过氧化物酶(HRP)逆行标记和生物素葡聚糖胺(BDA)顺行追踪技术,对PBN向VPM的上行投射及其终止部位进行了观察。逆标免疫组化SD大鼠24只,体重200～250g,雌雄不拘,分为3组,每组8只。第1、2组动物经戊巴比妥钠腹腔麻醉(40mg/kg)后开颅,将0.1μl的10%TMR(第1组)或0.05～0.1μl的30%HRP(第2组)分别定向注入右侧VPM。注射坐标为(mm):冠矢点后3.7～3.8,旁开2.4～2.5,进针深度6.3～6.4。注射用尖端粘外径为50～80μm微玻管的1μlHamilton微量注射器,注射时间为15～20min,注毕留针15min。动物存活4d后用过量戊巴比妥钠深麻,开胸,经心脏插管至升主动脉。先用0.9%盐水100ml冲净血液,再分别用含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PB,pH7.4)500ml(第1组)或含1%多聚甲醛和1.25%戊二醛的0.1mol/LPB500ml(第2组)灌注固定。注毕立即取脑,后固定4～6h,再移入30%蔗糖中至沉底(4℃)。将注射部位和脑桥吻段冠状冻切,片厚30μm,隔3张取1张,分4套收集于0.01mol/LPBS中(pH7.3)。将第1组动物的第1套切片裱于载片上,在荧光显微镜下观察注射区和PBN内的TMR逆标情况。选择注射区位于VPM内且PBN内有逆标神经元的动物的第2套切片,用ABC法进行TMR免疫组织化学染色:(1)切片入豚鼠IgG抗TMR血清(1∶1000,日本京都大学医学部金子武嗣先生惠赠)中孵育18～24h;(2)Biotin标记的驴抗豚鼠IgG血清(1∶200,Jackson)中孵育3h;(3)ABC混合液(1∶50,Vector)中孵育1h。孵育均在室温进行。抗体和复合物的稀释均用含0.3%的TritonX-100和5%正常马血清的PBS。PBS彻底清洗切片后,用二氨基联苯胺(DAB)、硫酸镍胺和H2O2呈色。裱片,中性红复染,脱水、透明、封片、光镜观察。将第1组动物的第3套切片丢弃。第2组动物的第1套切片经洗涤液(0.1mol/LPB,pH7.0)漂洗后,用硝普钠作稳定剂的TMB法呈色,其余处理同第1组。第3组动物麻醉后,用尖端粘微玻管的微量注射器将0.1μl的10%BDA水溶液缓慢注入左侧PBN。动物存活3d后深麻、开胸,先用0.9%的盐水冲净血液,再用500ml含4%多聚甲醛和0.05%戊二醛的PB灌注固定。注毕立即取脑,后固定3～6h;再移入30%蔗糖至沉底(4℃)。在脑桥右侧做标记,将PBN注射区及丘脑冠状冻切,片厚30μm,隔3张取1张,分4套收集于PBS中。先用PBS清洗第1套切片,再将切片置入含0.3%的TritonX-100和5%正常羊血清的PBS中孵育2h,次入ABC混合液中孵育3h,最后用硫酸镍胺加强的DAB法呈色。其余处理同第1组。将第1～3组动物的第4套切片行Nissl染色,以便对照观察。tmr逆标神经元的分布每组动物中均选择TMR和HRP注射区准确位于VPM和BDA注射区准确位于PBN的大鼠进行观察。第1组8只动物中,经免疫组织化学染色证实5只大鼠的TMR注射区位于VPM。将TMR注入右侧VPM后,PBN内的TMR逆标神经元主要位于注射区同侧的PBL和KF核,PBM内的TMR逆标神经元较少(图1～3),而对侧PBN内仅偶见TMR逆标神经元。5只大鼠第2套切片上注射区同侧PBL、KF核、PBM和注射区对侧PBL、KF核、PBM内TMR逆标神经元的平均数量分别为3257、2186、892和141、85、34。高倍镜下观察,PBL内的TMR逆标神经元多呈梭形或三角形,少数神经元呈多突形,胞体直径20～30μm,少数多突形神经元有明显的长突起(图2)。KF核内TMR逆标神经元大小均一,分布均匀,胞体直径多为15～20μm,胞体多呈三角形或卵圆形,突起较明显(图3)。PBM内的TMR逆标神经元大小不一,多呈梭形或三角形,胞体长径10～20μm,短径5～10μm,部分逆标神经元呈有多个突起的圆形,胞体直径10～20μm(图2)。PBL的内外侧亚核(IL)中也可见一些淡染的TMR逆标神经元(已计入PBL的逆标神经元总数),细胞呈小圆形,直径10～15μm,分布均匀,很少见突起(图4)。此外,在小脑上脚内也能见到少许TMR逆标神经元(图1,2)。第2组8只动物中,经TMB呈色后证实6只大鼠的HRP注射区位于VPM,HRP注射区可见较明显的中心区及扩散区。HRP逆标神经元多位于内侧PBN,对侧较少见,HRP逆标神经元主要位于PBL、KF核及PBM(图5),其分布特点和形态学特征与TMR逆标神经元相似。6只大鼠第1套切片注射区同侧PBL、KF核、PBM和注射区对侧PBL、KF核、PBM内TMR逆标神经元的平均数量分别为2985、1763、596和118、53、17。HRP逆标神经元的平均数量少于TMR逆标神经元的平均数量。第3组8只动物中,经DAB呈色证实4只大鼠的BDA注射区位于左侧PBN。BDA顺标纤维和终末密集地分布于同侧VPM和丘脑腹后外侧核(VPL)内(图6),对侧VPM和VPL内也能见到中等密度的BDA顺标纤维和终末(图7)。VPM内BDA顺标纤维和终末的分布区基本上与VPM内TMR和HRP的注射区重叠。此外,在同侧的丘脑胶状质核(SM)(图8)和丘脑后核(PO)内可见中等密度的BDA顺标纤维和终末。高倍镜下可见BDA顺标纤维呈串珠状,有较多的膨体,其终末呈点状(图6～8)。hrp和丘脑vpm的结构基础较早的研究仅观察到PBN向丘脑内板内核团投射。机能学研究证实PBN是味觉和内脏感觉信息传导路的中继站,与血管活动和呼吸调节等也有密切关系。但随着对PBN研究的不断深入,人们发现大量躯体感觉信息也传入PBN,如与面口部躯体伤害性信息传递有关的三叉神经脊束核尾侧亚核(Vc)的神经元向PBN投射,这些结果提示PBN在躯体感觉信息(特别是躯体伤害性信息)的传递过程中起重要作用。本研究用逆行和顺行标记技术发现主要参与内脏活动调控和内脏感觉信息传递的PBN向丘脑内躯体感觉信息的特异性中继核——丘脑VPM投射,此结果为从机能上进一步探索PBN在躯体感觉信息(特别是躯体伤害性信息)的传递和调控过程中的作用,提供了新的形态学资料。神经束路追踪技术对示踪剂的基本要求是注射区局限、追踪的灵敏度高、追踪结果便于观察和保存。为了确认逆行追踪结果的可靠性,还常常需要用顺行追踪方法来验证,反之亦然。本研究首先用TMR和HRP两种逆行示踪剂观察了PBN向丘脑VPM的上行投射,又用BDA顺行追踪方法验证了TMR和HRP逆行追踪的结果。在丘脑VPM内TMR和HRP的注射部位和扩散范围基本一致的情况下,从逆标神经元的计数结果来看,TMR的逆标结果优于HRP的逆标结果。TMR是最近开发的荧光素示踪剂,其主要组成部分是罗达明(rhodamine),在保持了罗达明比较敏感、不易被过路纤维吸收、可用荧光显微镜直接观察和不易退色的优点外,还可用TMR的特异性抗体进行免疫荧光或免疫组织化学染色,染色后不仅更易显示TMR标记神经元的突起,而且便于保存、免疫荧光双标染色及电镜观察,但不足之处是在电镜水平TMR的DAB反应产物与其他免疫组织化学染色的反应产物不易区别。HRP是最有效的示踪剂之一,HRP催化TMB反应后形成的形态独特的针状结晶,使HRP常被用于电镜水平的束路追踪研究,但注射区易扩散和不易判定、敏感性较低、过路纤维吸收、反应过程较复杂和产物不稳定是HRP追踪方法的缺点。生物素葡聚糖胺(biotinylateddextranamine,BDA)也是近年开发的顺行追踪剂,其主要成分是生物素(biotin),按照ABC法的原理,用标记荧光素或酶的卵白素(avidin)经孵育与BDA结合后,可以直接用荧光显微镜观察或经组织化学反应后在光镜、电镜下观察。根据实验要求,BDA可以选择压力或电泳的方式注入特定的核团。由于BDA的分子量(约3000)较小,3～5d即可被运输到很细的轴突分支和终末部位,较好地显示投射纤维的终末形态和终止部位。与现在的主要顺行示踪剂PHA-L相比,BDA具有注入途径多、运输时间短、显示过短简单等优点,但压力注射时注射区易扩散是其不足。经典的神经解剖学理论认为丘脑腹后内侧核(VPM)主要接受三叉丘系的传入投射,三叉丘系的上行投射纤维还终止在丘脑内板内核团、SM、PO等部位,再由这些核团发生纤维投射至大脑皮质躯体感觉代表区。隋鸿锦等观察到猫丘脑VPM内的突触形式以轴-树突触为主,同时还存在少量轴-体突触、树-树突触和轴-轴-树连续性突触,一般认为轴-轴-树连续性突触是突触前抑制的结构基础。在VPM可见以树突为中心的汇聚型突触复合体,在中央树突的周围同时有3个以上的突触前成分与之形成突触,这些复合体是丘脑VPM接受各种信息的结构基础。至于丘脑VPM的终末来源,所见报道文献较少。丘脑VPM内含圆形小泡的小轴突(SR)终末的来源,目前有两种观点:Jones认为全部SR终末均是大脑皮质神经元的轴突终末,但Guillery等则认为只有部分SR终末发自皮质神经元。Peschanski等的研究证明大鼠丘脑VPM内含圆形小泡的大轴突(LR)终末来自三叉丘系。丘脑VPM内含扁平小泡的轴突(F)终末主要起源于网状结构向丘脑发出的上行投射纤维。Houser等已证明网状结构向丘脑发出的上行投射纤维的F终末含γ-氨基丁酸(GABA),故F终末对丘脑VPM向大脑躯体感觉区投射的神经元可能有抑制作用。本研究的结果表明大鼠PBN神经元向丘脑VPM投射,但这些上行投射的轴突终末是属于哪种类型及含何种神经活性物质则需要进一步研究。感谢张淼丽和原悦萍同志在图片制作过程中的帮助。收稿1998-07修回1998-12本文图1～8见插图第5页图版说明图1将TMR注入丘脑VPM后,PBN内TMR逆标神经元的分布。KF.KF核PBL.臂旁外侧核PBM.臂旁内侧核scp.小脑上脚Vme.三叉神经中脑核标尺示200μm图2图1中a区的高倍像,示PBL和PBM内的TMR逆标神经元标尺示100μm(图3～5与此相同)图3图1中b区的高倍像,示KF核内的TMR逆标神经元图4PBL的内外侧亚核(IL)内的TMR逆标神经元图5将HRP注入丘脑VPM后,PBN内的HRP逆标神经元图6将BDA注入左侧PBN后,BDA顺标纤维和终末在同侧丘脑VPM和VPL内的分布。标尺示40μm(图7,8与此相同)图7BDA顺标纤维和终末在对侧丘脑VPM和VPL内的分布图8BDA顺标纤维和终末在同侧丘脑胶状质核(SM)内的分布。mt.乳头丘脑束ExplanationoffiguresFig.1DistributionofTMRretrogadelylabeledneuronsintheparabrachialnucleus(PBN)afterinjectionTMRintothethalamicventralposteromedialnucleus(VPM).KF,KollikerFusenucleus;BPL,lateralparabrachialnucleus;PBM,medialparabrachialnucleus;scp,superiorcerebellarpeduncle;Vme,trigeminalmesencephalicnucleus.Bar=200μmFig.2TheenlargementofrectangleainFig.1,showingTMRretrogradelylabeledneuronsinthePBLandPBM.Bar=100μmandalsoforFigs.3-5.Fig.3TheenlargementofrectanglebinFig.1,showingTMRretrogradelylabeledneuronsintheKFnucleus.Fig.