雌激素对大鼠下丘脑中bcl-2和bax表达的影响

雌激素对大鼠下丘脑中bcl-2和bax表达的影响

雌激素是一种调节身体各种生理功能的激素，广泛用于生殖系统、心血管系统和骨组织。近年来,雌激素对中枢神经系统的保护作用引起了人们的重视。雌激素能减轻缺血-再灌注损伤、降低兴奋性氨基酸的释放、减少自由基的形成并改善记忆。研究发现,下丘脑多个核团的神经元细胞核及突起中都存在大量雌激素受体。此外,更年期的机能紊乱伴随着脑尤其是下丘脑神经元功能的紊乱。以上研究表明,雌激素在下丘脑生理作用的调控方面起着重要作用,但有关切除卵巢及雌激素补充治疗后大鼠下丘脑中Bcl-2和Bax蛋白表达影响的报道甚缺。本研究旨在利用免疫组织化学方法观察去除双侧卵巢及17-β雌二醇补充治疗后,大鼠下丘脑中Bcl-2和Bax蛋白表达的变化,探讨雌激素对下丘脑功能调控的机制,为临床上治疗由缺乏内源性雌激素引起的神经内分泌紊乱、生殖功能低下和感觉功能传导障碍等提供形态学理论依据。1材料和方法1.1卵巢切除及治疗健康雌性SD大鼠(第四军医大学实验动物中心提供)共30只,3月龄,体重210～240g,随机分为3组:第1组假手术组(C组);第2组卵巢摘除组(OVX组);第3组卵巢摘除并用17β-雌二醇治疗组(OVX+E2组)。每组各10只,采用0.1g/mL水合氯醛腹腔麻醉大鼠,C组做假手术,OVX和OVX+E2组摘除双侧卵巢,手术1周后,OVX+E2组隔天皮下注射17β-雌二醇(Sigma公司产品,溶于无水乙醇,注射剂量参照Suresh等的试验结果)10μg/只,C组和OVX组皮下注射等量无水乙醇,连续注射4周。1.2连续冠状冰激凌切片末次注射17β-雌二醇后24h,各组大鼠以0.1g/mL水合氯醛腹腔麻醉,经主动脉插管,用37℃生理盐水冲洗净血液,以40g/L多聚甲醛磷酸缓冲液(pH7.4)300mL灌注固定,取出下丘脑入相同固定液中后固定6～12h,再移入含0.2g/mL蔗糖的PB溶液(4℃)中直至组织块沉底。进行连续冠状冰冻切片,片厚30μm,切片分为3套,2套分别用于免疫组织化学Bcl-2和Bax染色,剩下1套大部分用常规组织学HE染色进行核团定位,小部分用于阴性对照。核团定位按照Pellegrino等的大鼠脑图谱定位。1.3ss-bs-pax-bax抗体的制备免疫组织化学染色程序按照SP试剂盒(福州迈新生物公司产品)说明进行,第一抗体(武汉博士德公司产品)Bcl-2、Bax多克隆抗体的工作浓度分别为1∶150和1∶200。同时设阴性对照组,用0.01mol/LPBS代替第一抗体,其余步骤相同。硫酸镍胺增强的DAB蓝色体系呈色,贴片,晾干,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜观察。阳性产物呈深蓝色或蓝色,阴性对照组无阳性产物。1.4动物阳性细胞表达将制得的切片在光学显微镜下观察、记录,Motic数码显微镜拍照,用江苏捷达801形态分析软件对阳性细胞进行分析,每组动物每个部位随机选取5张切片,测量阳性细胞的数目及灰度值(灰度值越大说明表达强度越弱),用平均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,t检验统计学处理。2不同类型大鼠血清中bcl-2表达强度的变化试验采用免疫组织化学SP法及硫酸镍胺增强的DAB蓝色显色体系,阳性产物为蓝黑色或蓝色,阴性对照无色。C组、OVX组和OVX+E2组中,Bcl-2和Bax阳性产物广泛分布于下丘脑多个核团,主要定位于胞质、胞膜及核膜中,也分布于突起中(见图1)。去除卵巢及加雌激素治疗后Bcl-2和Bax表达出现不同变化(见表1)。去除卵巢后,下丘脑背内侧核(nucleusdorsomedialhypothalamus,DMH)中Bcl-2阳性细胞数和表达强度均显著下降(P<0.01),补充雌激素之后其表达强度显著上升,接近假手术对照组(P>0.05)。去除卵巢后,下丘脑腹内侧核(nucleusventromedialhypothalamus,VMH)中Bcl-2阳性细胞数和表达强度均显著下降(P<0.01),而Bax表达量显著上升(P<0.05),补充雌激素之后,Bcl-2表达量显著回升(P<0.01),而Bax表达量显著下降(P<0.01)。去除卵巢后,下丘脑室旁核(nucleusparaventricularhypothalamus,PVH)和视上核(nucleussupraopticushypothalamus,SOH)中Bcl-2阳性细胞数和表达强度不同程度下降(P<0.05),而Bax阳性细胞数和表达强度不同程度上升(P<0.05);下丘脑弓状核(nucleusarcuatushypothalamus,AUH)中,Bcl-2表达强度显著下降(P<0.05),Bax表达强度显著上升(P<0.05)。3发育机械神经元的保护作用下丘脑是中枢神经系统维持机体内环境稳定的重要部位。研究证实哺乳动物下丘脑外侧核、下丘脑前核、乳头体、视前内侧区、弓状核和室旁核等均有不同程度的雌激素受体分布。表明雌激素在下丘脑中起着重要而广泛的调节作用。前期的研究表明,雌激素能够不同程度地下调大鼠小脑和海马中Bax蛋白的表达,上调Bcl-2蛋白的表达,从而对该区神经元具有保护作用。本试验结果显示,切除大鼠双侧卵巢后,由于体内缺乏内源性雌激素,下丘脑中Bcl-2和Bax阳性细胞数目及表达强度在各个核团出现了不同的变化。DMH是下丘脑中与情绪有关的中枢中诱发神经原性冠脉痉挛最敏感的部位,在调节与情绪有关的心血管反应中起重要作用。最近有研究者提出,DMH与睡眠觉醒的昼夜节律有关。本研究发现,切除卵巢后由于缺乏内源性雌激素,DMH神经元内Bcl-2的表达显著下降,Bax表达有所上升,使Bcl-2与Bax比值下降,提高神经元对凋亡刺激的敏感性;补充17β-雌二醇后,Bcl-2表达上升,Bax表达下降,表明雌激素在此区主要通过上调Bcl-2的表达发挥神经保护作用。VMH是下丘脑基底部最大的核团,大量研究表明VMH是调控摄食的饱中枢。试验结果表明,在此区雌激素通过上调Bcl-2表达的同时下调Bax的表达,对VMH神经元发挥神经保护作用。PVH和SOH参与温度调节、渗透压调节及一系列协调反应,与动物的渴觉感受及水盐平衡代谢密切相关。SOH和PVH内含有多种神经活性物质,尤其是肽类物质,如加压素、催产素、脑啡肽、强啡肽、促肾上腺皮质激素释放激素、神经降压素、胆囊收缩素等,其中以加压素和催产素含量最多。SOH和PVH不仅与机体水盐平衡、分娩、泌乳等有关,还和学习记忆、体温调节及镇痛等作用有关。PVN还参与血管活动的调节,是维持心血管稳定的一个重要调控系统。一旦异常会直接影响上述正常的生理功能,推测这与更年期妇女各个系统都易于出现不适症状,乃至患病有关。在本试验中,切除卵巢后PVH和SOH中Bcl-2阳性细胞数及其表达强度显著降低,Bax阳性细胞数及其表达强度显著上升,使得该区神经元抗凋亡能力极度下降,在补充雌激素后,Bax表达显著降低,而Bcl-2蛋白表达有所上升。表明雌激素保护PVH和SOH神经元免受凋亡,从而维持其神经内分泌功能的发挥。AUH是内侧基底下丘脑的中心区,含有多种神经递质及肽类物质,如促性腺激素释放激素(GnRH),生长激素抑制因子(SRIF),促黑色素细胞激素(MSH),β-内啡肽和近来研究焦点的神经肽Y(NPY)等,是调节下丘脑激素分泌闸门系统的中枢,参与机体生殖、摄食、情绪、应激、觉醒睡眠、痛觉和内脏活动等的调制,另外它还是性激素反馈作用的直接靶器官。老年弓状核神经元具有衰老性变化,其内β-内啡肽能、促肾上腺皮质激素样和生长抑素样神经元的老龄变化已有报道。有研究表明,切除大鼠卵巢,弓状核中的ERβmRNA显著下降。本试验中,切除大鼠双侧卵巢后,弓状核内Bcl-2蛋白表达显著下降,Bax蛋白表达极显著上升,推测弓状核内神经元对凋亡敏感性增加,部分解释了绝经后妇女由于缺乏雌激素而至的控制情绪、觉醒和睡眠等功能的减退,而补充外源性雌激素可逆转上述变化,表明雌激素在此区发挥了重